仲曉露，沈 燁，張興德,3,5*，劉永海，井山林,4，謝 輝，狄留慶,5，郁紅禮,3,4，陳希宇，胡若楠

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院鹽城市中醫(yī)院，江蘇鹽城 224001；3.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；4.江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023；5. 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023）

黃芩始載于《五十二病方》[1]，為唇形科植物黃芩ScutellariaebaicalensisGeorgi 的干燥根，性苦、寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具清熱利濕、降火解毒、止血安胎等功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，黃芩在抗氧化、抗腫瘤和抗炎等方面作用良好[3]，其化學(xué)成分包括黃酮類、揮發(fā)油類、多糖類等，以黃酮類化合物占比最大[4]，是黃芩主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

提取是影響中藥產(chǎn)品質(zhì)量和療效的重要單元，目前車間的提取生產(chǎn)仍以人工操作控制模式為主。2016年，國(guó)家工信部《醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃指南》[5]提出：“采用過程分析技術(shù)（PAT）優(yōu)化制藥工藝和質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)藥品從研發(fā)到生產(chǎn)的技術(shù)銜接產(chǎn)品質(zhì)量一致性”，要求將PAT 技術(shù)、提取工藝優(yōu)化和過程質(zhì)控相融合。因此，課題組以黃芩為研究對(duì)象，通過建立黃芩中黃酮類單成分的浸提動(dòng)力學(xué)模型，為黃芩提取的工藝優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)有效控制浸提過程；通過對(duì)黃芩浸提液進(jìn)行生物效應(yīng)評(píng)價(jià)，從制藥源頭保證藥品質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

黃芩飲片（批號(hào)：20200801，永州市永靛中藥飲片有限公司），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariaebaicalensisGeorgi 的干燥根；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-20030408,純度：98.95%）、漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-21120601,純度：99.06%）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-21101117,純度：98.71%）和漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-21030911,純度：99.77%）均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；乙醇為分析純；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；DPPH(上海源葉生物科技有限公司)；胎牛血清（美國(guó)Gibico 公司）；DMEM（武漢普諾賽生命科技有限公司）；LPS（上海麥克林生化科技有限公司）；NO 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器

MEI04E 型電子天平［梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司］；e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；T6 新世紀(jì)型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Spectra Max i3X 型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮類單成分含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Hedera ODS-2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫50 min，洗脫程序見表1；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 黃酮類單成分含量測(cè)定梯度洗脫表Tab. 1 Gradient elution table for determination of flavonoid single component content

2.1.2 溶液的制備 （1） 對(duì)照品溶液的制備精密稱定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，定容至10 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為 0.322 0 mg/mL、0.084 2 mg/mL、0.054 4 mg/mL 和0.020 7 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液1、0.5、0.1、0.1 mL 配制成混合對(duì)照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜濾過，進(jìn)樣量為10 μL，色譜圖見圖1。

（2） 供試品溶液的制備 稱定黃芩飲片10.0 g，置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水100 mL，回流提取1 h。趁熱過濾，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，色譜圖見圖1。

2.1.3 方法學(xué)考察 （1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25、30、35 和40 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 黃酮類單成分線性回歸方程表Tab. 2 Single component linear regression equation of flavonoid

（2） 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄峰面積。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD 分別為0.26%、0.40%、0.58%和0.72%，表明儀器精密度良好。

（3） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，分別在配制后的0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD 分別為0.65%、1.36%、1.60%和1.64%，表明提取液制備后在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（4） 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定黃芩飲片10.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)操作6 次。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均含量分別為26.58 mg/g、6.23 mg/g、1.02 mg/g、0.44 mg/g，RSD分別為1.60%、1.87%、1.55%和1.86%，表明方法重復(fù)性良好。（5） 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃芩飲片6 份，分別準(zhǔn)確加入混合對(duì)照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均加樣回收率分別為99.47%、98.89%、98.16%和98.40%，RSD 分別為0.78%、1.31%、2.88%和2.97%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.4 樣品測(cè)定 稱定黃芩飲片10.0 g，加入蒸餾水130 mL 進(jìn)行回流提取，分別在5、10、15、20、25、30、40、50 和60 min 取提取液5 mL 并補(bǔ)充5 mL 蒸餾水，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 黃芩HPLC 含量測(cè)定結(jié)果（n = 2）Tab. 3 Determination results of Scutellariae Radix by HPLC（n = 2）

2.2 浸提動(dòng)力學(xué)方程的構(gòu)建

2.2.1 理論基礎(chǔ) 本實(shí)驗(yàn)采用基于Fick’s 擴(kuò)散定律，通過簡(jiǎn)化帶入、參數(shù)融合等手段，推導(dǎo)形成中藥煎煮過程的動(dòng)力學(xué)方程。

根據(jù)Fick’s 擴(kuò)散定律[6-7]和Higbie 傳質(zhì)穿透模型理論[8]，韓林辛等[9]推導(dǎo)出適于多數(shù)藥材的提取動(dòng)力過程總方程：

2.2.2 動(dòng)力學(xué)模型的建立和驗(yàn)證 （1） 干藥材吸溶劑率R的測(cè)定 稱定藥材約 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g，將其分別置于 500 mL 的圓底燒瓶中，加蒸餾水300 mL，加熱回流30 min，濾過，取出稱重。以吸水量（Y）對(duì)飲片干重（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖2。方程的斜率即為干藥材吸溶劑率R，即R=1.512 5。

（2）f1的測(cè)定與計(jì)算：f1可用公式（4）表示：

其中，C1b-C10即為C有效成分，基于本實(shí)驗(yàn)，該值代表本批黃芩飲片中四種黃酮類單成分的含量。以2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）“黃芩”項(xiàng)下含量測(cè)定中對(duì)供試品溶液的處理方法制備黃芩飲片的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，得本次實(shí)驗(yàn)所用黃芩飲片中得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的f1分別為0.070 0、1.612×10-2、2.443×10-3和8.143×10-4。

（3） n 和α 值的測(cè)定與計(jì)算 固定溶劑倍量M= 5 mL/g，在提取30、60、90、120、150 min 時(shí)，分別取出提取液5 mL 并補(bǔ)充5 mL，提取液放冷后測(cè)定；固定溶劑倍量M= 10、15、20 mL/g 重復(fù)上述操作。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做ln[t1/2/（M-R）]和lnCB的線性回歸，將所得回歸方程與公式（3）中相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立，可得n和α的值，結(jié)果見圖3。將回歸方程和公式（3）中相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立，得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的1/（1-n）的值分別為0.770 5、0.796 2、0.793 2、0.769 5，1/（1-n）lnαf1的值分別為1.860 7、0.405 5、-1.495 6、-2.403 7,即黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的n值分別為-0.297 9、-0.256 0、-0.260 7 和-0.299 5，α值分別為159.841 9、0.010 3、6.211×10-5和5.403×10-7。

（4） 模型的建立 將以上求得的R值、f1值、n值和α值代入公式（5）中求得本次研究所建立的黃芩中黃酮類單成分浸提動(dòng)力學(xué)方程，黃芩苷：CB= [11.188 9×t1/2/（M-1.512 5）]0.7705、漢黃芩苷：CB= [1.660 4×10-4×t1/2/（M-1.512 5）]0.7962、黃芩素：CB= [1.517 3×10-7×t1/2/（M-1.512 5）]0.7932、漢黃芩素：CB= [4.399 7×10-10×t1/2/（M-1.512 5）]0.7695。

根據(jù)所建立的動(dòng)力學(xué)方程式，在溶劑倍量為13倍的情況下，對(duì)黃芩提取液在5、10、15、20、25、30、40、50 和60 min 時(shí)四種黃酮類單成分的濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有黃芩苷的預(yù)測(cè)結(jié)果良好，結(jié)果見表4。由表4 中數(shù)據(jù)可知，黃芩苷的預(yù)測(cè)值（Cpre）和真實(shí)值（Cexp）吻合良好，標(biāo)準(zhǔn)偏差值與工業(yè)要求相符。因此，本實(shí)驗(yàn)所建立的黃芩苷浸提動(dòng)力學(xué)模型能夠較好地反映黃芩飲片中黃芩苷的溶出規(guī)律。

表4 黃芩苷動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證結(jié)果Tab. 4 Validation results of baicalin kinetic model

2.3 生物效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.3.1 抗氧化試驗(yàn) （1） 溶液的制備 黃芩浸提液：稱取黃芩飲片10.0 g，加蒸餾水100 mL，浸泡30 min 后100℃提取150 min，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120、150 min 取3 mL 提取液并補(bǔ)充蒸餾水3 mL。

DPPH 溶液：精密稱取7.91 mg 的DPPH 粉末，用無水乙醇定容至100 mL，配制成0.2 mmol/L 的DPPH 儲(chǔ)備液，0℃保存。

（2） DPPH清除率的測(cè)定 分別取提取液1 mL于試管中，加入0.2 mmol/L 的DPPH 溶液4 mL 振蕩混勻，常溫下密封后置于避光處反應(yīng)30 min。在517 nm處測(cè)定其吸光度 （A樣品）。再測(cè)定4 mL 的0.2 mmol/L的DPPH 溶液與1 mL 無水乙醇的吸光度A空白，樣品液1 mL 加4 mL 無水乙醇的吸光度（A對(duì)照），計(jì)算DPPH清除率，DPPH 清除率=［1- （A樣品-A對(duì)照）/A空白］×100%）。重復(fù)操作3 次，結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)黃芩浸提液在浸提的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)DPPH 自由基均有良好的清除效果，長(zhǎng)時(shí)間的加熱對(duì)浸提液抗氧化活性并無裨益。

2.3.2 抗腫瘤試驗(yàn) （1） 溶液的制備 同“2.3.1”。

（2） sgc-7901 細(xì)胞增殖抑制測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，離心（1 000 rpm，5 min，室溫），收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/mL，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中。24 h 后，細(xì)胞貼壁，吸出培養(yǎng)基，給藥。設(shè)置空白組（不加細(xì)胞不給藥）、對(duì)照組（加細(xì)胞不給藥）和給藥組（加細(xì)胞給藥），每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，37 ℃下孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm下的各孔吸光度值（OD）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率{細(xì)胞增殖抑制率（%）= [1-（OD給藥組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）]×100%}，并 以Graphpad Prism 軟件作圖，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，黃芩浸提液對(duì)胃癌細(xì)胞sgc-7901 的增殖具抑制作用，隨著加熱提取時(shí)間的推移，抗腫瘤作用逐漸減弱，說明黃芩中的抗腫瘤活性物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)控制提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

2.3.3 抗炎試驗(yàn) （1） 溶液的制備 同“2.3.1”。

（2） 浸提液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，離心（1 000 rpm，5 min，室溫），收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至2×104個(gè)/mL，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中。24 h 后，細(xì)胞貼壁，吸出培養(yǎng)基，給藥。設(shè)置空白組（不加細(xì)胞不給藥）、對(duì)照組（加細(xì)胞不給藥）和給藥組（加細(xì)胞給藥），每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，37 ℃下孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 下的各孔吸光度值（OD）。計(jì)算細(xì)胞存活率：

并以Graphpad Prism 軟件作圖，結(jié)果見圖6。由圖6 可知，浸提液中細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存活率均大于80%，說明選擇的藥液濃度對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力無明顯影響，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

（3） 浸提液對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO釋放的影響 將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/mL，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中。設(shè)置空白組（不給LPS 不給藥）、對(duì)照組（給LPS 不給藥）和給藥組（給LPS 給藥），每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后取上清，用NO 試劑盒測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以Graphpad Prism 軟件作圖，結(jié)果見圖7。由圖7 可知，與空白組相比，對(duì)照組的NO 含量明顯升高；與對(duì)照組比較，黃芩在提取20 min 后其浸提液能明顯降低細(xì)胞上清液中NO 含量。

3 討論

目前，中藥提取存在著勞動(dòng)強(qiáng)度高、工藝參數(shù)波動(dòng)大、批次間產(chǎn)品質(zhì)量不均一等問題，其根本原因是提取理論的缺乏。課題組在黃芩飲片的提取研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，以響應(yīng)面法優(yōu)化浸提工藝的傳統(tǒng)方式并不符合實(shí)際生產(chǎn)要求。基于文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)通過對(duì)中藥提取過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究可解決上述問題。提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型可表達(dá)中藥成分在水中溶出的動(dòng)態(tài)過程，闡明提取機(jī)理，從而有效控制提取過程。課題組前期以擬合結(jié)果和應(yīng)用范圍為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，比較了多種經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃臀锢砟Ｐ蚚12]，最終選定基于Fick’s 擴(kuò)散定律建立的物理模型作為黃芩浸提動(dòng)力學(xué)研究模型。目前該模型多應(yīng)用于中藥飲片中某類成分（如黃酮類、多糖類）的提取研究。本實(shí)驗(yàn)探索性地將該模型應(yīng)用于四種黃酮類單成分，結(jié)果表明，僅黃芩苷的溶出符合此模型，其浸提動(dòng)力學(xué)方程為：CB= [11.188 9×t1/2/（M-1.512 5）]0.7705。猜測(cè)漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素不適用于該動(dòng)力學(xué)模型的原因是這三者在黃芩飲片中的含量較低?；谒鶚?gòu)建的黃芩苷浸提動(dòng)力學(xué)方程，可快速預(yù)判提取因素變化對(duì)黃芩苷溶出的影響，縮短對(duì)浸提階段的研究時(shí)間，并有效控制提取過程。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，自由基、腫瘤和炎癥三者相互關(guān)聯(lián)[13]。目前對(duì)中藥浸提液抗氧化、抗腫瘤和抗炎效果的評(píng)價(jià)多以終產(chǎn)物為研究對(duì)象，缺乏對(duì)浸提過程中生物效應(yīng)變化的評(píng)價(jià)。故本研究從抗氧化、抗腫瘤和抗炎三個(gè)方面對(duì)浸提過程中黃芩浸提液的生物效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)黃芩浸提液的抗腫瘤活性物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定，提示在黃芩實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間加熱提取。同時(shí)，抗炎結(jié)果表明黃芩浸提液在提取20 min后方可明顯抑制炎癥因子NO 的釋放，因此，如何平衡提取時(shí)間是制藥企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中須關(guān)注的問題。課題組后續(xù)將針對(duì)該問題深入研究，以期為黃芩浸提液的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了黃芩飲片中主要藥效成分黃芩苷的浸提動(dòng)力學(xué)方程，從細(xì)胞層面明確了浸提過程中黃芩的相關(guān)藥效變化，為黃芩浸提的工藝選擇和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。但目前研究?jī)H在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)進(jìn)行，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究并進(jìn)行中試放大試驗(yàn)，以期與實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合。