鄭傳明，紀(jì) 忠，徐志鵬，杜召輝，竇賀賀，姜 海，王振杰

作者單位：蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科，蚌埠 233000

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種常見的外科急腹癥，其發(fā)病率和病死率都很高，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制知之甚少，也沒有特異性或有效的治療方法[1-2]。多項(xiàng)研究[3-4]表明，AP的發(fā)病機(jī)制與自噬失調(diào)和持續(xù)的炎癥密切相關(guān)。中文名小RNA(microRNA，miRNA)是長(zhǎng)度為18～25 nt的單鏈非編碼小分子RNA，近年來其在AP中的作用受到了廣受關(guān)注。相關(guān)研究[5-7]表明，miR-146a在炎癥和先天性免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)節(jié)作用，且有個(gè)別報(bào)道[8]顯示miR-146a有作為AP預(yù)后標(biāo)志物的潛力，但其在AP中的具體作用機(jī)制尚未見研究。該研究利用?；鞘懰?磷酸鹽(taurolithocholic acid 3-sulphate，TLCs)處理AR42J細(xì)胞建立AP模型，探究miR-146a在AP中的作用及機(jī)制，為AP的機(jī)制研究提供新思路，更為AP精準(zhǔn)診療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料TLCs(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，miR-146a mimic及陰性對(duì)照(miR-ctrl)、si-IRAK1及陰性對(duì)照(si-ctrl)(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，引物(蘇州金唯智生物科技有限公司)，IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)、actin抗體(美國(guó)Abcam公司)、LC3、p62抗體、兔二抗(美國(guó)CST公司)，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，Ham's F-12K培養(yǎng)基、血清(美國(guó)Gibco公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒(日本Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及AP模型構(gòu)建 細(xì)胞復(fù)蘇于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含有20%的胎牛血清的Ham's F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中設(shè)置的條件為37℃、5%CO2。細(xì)胞傳3代后，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，分別加入100、200 μmol/L TLCs，40 min后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄 將處理好的細(xì)胞均勻地鋪在培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1次，每孔加入1 ml TRIzol，充分收集細(xì)胞，加入200 μl氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min；4℃、12 500 r/min離心15 min；吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇，冰上靜置10 min，4℃、12 500 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 ml預(yù)冷好的75%乙醇溶液，重懸沉淀，4 ℃、12 500 r/min離心5 min，棄上清液，待沉淀變成無色透明狀，加入適量的RNase-free水溶解RNA，并檢測(cè)各組濃度。RNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光實(shí)時(shí)定量PCR的步驟參照試劑盒說明書。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3蛋白提取 將處理好的細(xì)胞均勻地鋪在培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1次，每孔加入300 μl細(xì)胞裂解液，冰上靜置15 min，4 ℃、13 000 r/min離心15 min；吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，留取一部分用來測(cè)蛋白濃度，剩余液體按照比例加入5×loading，煮10 min，放入-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞密度長(zhǎng)至培養(yǎng)板孔的80%～90%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。首先用50 μl opti-medium稀釋1 μl Lipofectamine 3000，再用50 μl opti-medium稀釋500 ng質(zhì)粒，加入1 μl T3000；充分混勻后，將質(zhì)粒和T3000混合物滴加到Lipofectamine 3000稀釋液中，室溫靜置15～20 min，滴加到24孔板培養(yǎng)基中。miRNA的轉(zhuǎn)染方法參照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建pMIR-IRAK1 wt 3’UTR及結(jié)合位點(diǎn)突變pMIR-IRAK1 mut1 和mut2 3’UTR質(zhì)粒。將上述3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，再次轉(zhuǎn)染miR-146a mimics或陰性對(duì)照，檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 TLCs誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞炎癥采用不同濃度(0、100、200 μmol/L)TLCs誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，檢測(cè)促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果表明，在用不同濃度TLCs處理的AR42J細(xì)胞中，TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平升高(圖1A)。ELISA分析顯示，在不同濃度TLCs刺激的AR42J細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，TNF-α和IL-6的蛋白水平也顯著增加(圖1B)。

2.2 TLCs抑制miR-146a促進(jìn)IRAK1表達(dá)并誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞自噬用不同濃度的TLCs處理AR42J細(xì)胞，通過qPCR和Western blot測(cè)定miR-146a和IRAK1的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，用100 μmol/L TLCs處理AR42J細(xì)胞，miR-146a表達(dá)降低率為(40±1.22)%，用200 μmol/L TLCs處理AR42J細(xì)胞，miR-146a表達(dá)降低約(60±0.98)%(圖2A)；但是，用100、200 μmol/L TLCs處理AR42J細(xì)胞，IRAK1 mRNA水平是對(duì)照組的(2.5±0.12)倍和(4±0.08)倍，蛋白水平也同樣有上升(圖2B、C)。表明miR-146a和IRAK1可能在AP的發(fā)展中起重要作用。此外，在用TLCs處理的AR42J細(xì)胞中，自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/Ⅰ比值和p62的表達(dá)水平也有所變化，即LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加、p62減少(圖2D)，提示TLCs可以抑制miR-146a、促進(jìn)IRAK1表達(dá)并誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.3 過表達(dá)miR-146a可以抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬為了研究miR-146a在AP中的功能作用，用Lipofectamine 3000分別向AR42J細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和miR-control，然后用TLCs(200 μmol/L)處理。qPCR和ELISA分析結(jié)果表明，在未加TLCs處理的條件下，過表達(dá)miR-146a未引起顯著的IL-6和TNF-α變化。在TLCs處理?xiàng)l件下，過表達(dá)miR-146a顯著降低IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平(圖3A、B)。自噬試驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-control的處理?xiàng)l件下，TLCs引起LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高和p62表達(dá)下降，該結(jié)果與前述結(jié)果一致；與轉(zhuǎn)染miR-control且添加TLCs處理相比，過表達(dá)miR-146a，即轉(zhuǎn)染miR-146a mimic+TLCs處理，顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比值且上調(diào)p62表達(dá)(圖3C)。以上結(jié)果說明，上調(diào)miR-146a可以抑制由TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬應(yīng)答。

2.4 敲減IRAK1可以抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬為了進(jìn)一步研究IRAK1在AP中的功能，在AR42J細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-IRAK1或siRNA-control，然后用TLCs處理(200 μmol/L)。Western blot結(jié)果表明，與siRNA-control組相比，si-IRAK1組中IRAK1的蛋白表達(dá)下降(圖4A)。敲減IRAK1顯著降低了TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白水平(圖4B、C)。此外，敲減IRAK1減弱了TLCs誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高和p62表達(dá)降低(圖4D)。該部分結(jié)果顯示，敲減IRAK1與上調(diào)miR-146a表達(dá)對(duì)TLCs誘導(dǎo)的AP細(xì)胞模型中具有相似的作用。

2.5 miR-146a在AR42J細(xì)胞中靶向IRAK1為了進(jìn)一步探索AP中miR-146a與IRAK1之間的關(guān)系，在AR42J細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a，再用TLCs處理細(xì)胞，Western blot和qPCR檢測(cè)IRAK1表達(dá)。結(jié)果顯示：miR-146a可以明顯抑制IRAK1表達(dá)，TLCs可以促進(jìn)IRAK1表達(dá)，同時(shí)加入miR-146a和TLCs，與只加TLCs組相比，IRAK1表達(dá)量也顯著降低(圖5A)，這說明miR-146a可以抑制IRAK1的表達(dá)。為了更深入探究miR-146a與IRAK1靶向關(guān)系，通過Targetscan在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)了miR-146a與IRAK1 3′UTR 的潛在結(jié)合位，并構(gòu)建野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型質(zhì)粒，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-146a與IRAK1靶向關(guān)系。結(jié)果表明，miR-146a的過表達(dá)強(qiáng)烈降低了IRAK1-wt的螢光素酶活性，而轉(zhuǎn)染miR-146a后，IRAK1-mut的螢光素酶活性未受到明顯影響(圖5B、C)。綜上所述，這些結(jié)果表明miR-146a可以直接靶向IRAK1。

圖1 TLCs誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞炎癥

圖2 TLCs抑制miR-146a促進(jìn)IRAK1表達(dá)并誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞自噬

圖3 過表達(dá)miR-146a抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬

圖4 敲減IRAK1可以抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥和自噬

圖5 miR-146a在AR42J細(xì)胞中靶向IRAK1

3 討論

AP具有不同的臨床病程。大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕度AP，具有自限性，通常在1周內(nèi)消退。大約20%的患者發(fā)展為中度或重度AP，伴有胰腺或胰周組織壞死，或是器官衰竭，亦或兩者兼有，病死率高達(dá) 20%～40%[1-2]。更為重要的是，目前，臨床尚無可以改變AP疾病進(jìn)程的藥物。因此，深入研究AP的發(fā)病機(jī)制，可能為AP的機(jī)制研究提供新思路，更可能為其治療提供新的靶點(diǎn)。

有研究[3]顯示，AP會(huì)導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的細(xì)胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和溶酶體-自噬系統(tǒng))受損，并使細(xì)胞器功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致胰蛋白酶原和炎癥通路的激活。自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的分解代謝過程，細(xì)胞通過該過程消除受損、有缺陷或不需要的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，并產(chǎn)生能量滿足細(xì)胞代謝需要。相關(guān)研究[9]顯示，在轉(zhuǎn)基因GFP-LC3小鼠中，GFP-LC3的表達(dá)對(duì)肝、肺和脾的自噬影響很小或沒有影響，但可以顯著增加胰腺腺泡細(xì)胞中的自噬體形成。另一項(xiàng)研究[10]顯示，抑制AP小鼠的自噬可以改善小鼠的預(yù)后。本研究也表明，在AP的細(xì)胞模型中，隨著TLCs濃度的逐漸增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值逐漸升高、p62逐漸降低，同時(shí)，在炎癥和先天性免疫應(yīng)答中起著重要負(fù)性調(diào)節(jié)作用的miR-146a表達(dá)量也逐漸降低。上調(diào)miR-146a可以顯著抑制TLCs誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞自噬。說明miR-146a可調(diào)控TLCs誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞自噬，且miR-146a的表達(dá)與AP的進(jìn)展密切相關(guān)。

眾所周知，巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起重要作用。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，它們可損傷附近組織和遠(yuǎn)處器官。抑制胰腺炎相關(guān)巨噬細(xì)胞的活化不僅減輕了胰腺本身的病理?yè)p傷，而且在一定程度上減少了全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭的發(fā)生[11]。研究[12]顯示通過腹腔灌洗清除巨噬細(xì)胞后AP小鼠的TNF-α、IL-6和IL-10血清水平降低。本研究顯示，TLCs可以促進(jìn)炎癥因子IL-6和TNF-α分泌，且隨著TLCs的濃度逐漸增加，IL-6和TNF-α的表達(dá)量也逐漸增加。同時(shí)，TLCs可抑制AR42J細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)、促進(jìn)IRAK1表達(dá)。IRAK1是介導(dǎo)的NF-κB活化途徑的重要元件，NF-κB對(duì)于炎性反應(yīng)和介導(dǎo)炎性因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)的釋放是重要的，并可加劇炎性損傷[13]。NF-κB在AP相關(guān)巨噬細(xì)胞激活過程中起重要作用[14]。本研究在AR42J細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a，顯著抑制TLCs誘導(dǎo)的炎癥及IRAK1的表達(dá)。結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步證明了miR-146a可以靶向調(diào)控IRAK1的表達(dá)。這些結(jié)果提示miR-146a和IRAK1極可能是AP治療的潛在靶點(diǎn)。