沈子園，賀晨露，閆冬梅，王祥民，孫 財，桑 威，黃水平，孫 晗

作者單位：1徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，徐州 2210042徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，徐州 221006

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，通過自分泌/旁分泌方式特異地作用于血管內(nèi)皮細胞上的受體，由腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞所合成。其可誘導(dǎo)血管生成，以維持或恢復(fù)細胞局部氧和營養(yǎng)供應(yīng)所需的毛細血管網(wǎng)的增殖和擴張，減少局部組織缺血[1-2]，在多種癌癥血管生成和進展中起著重要作用[3]。彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型。由于DLBCL的高度異質(zhì)性，其預(yù)后因患者年齡，臨床病理特征和遺傳因素而異?；谂R床變量的國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index，IPI)是預(yù)測DLBCL患者預(yù)后的常用模型[4]。目前，探討VEGF水平對DLBCL預(yù)后影響的相關(guān)報道較少，因此該研究回顧性收集了203例初診為DLBCL且具有VEGF確切數(shù)值的患者數(shù)據(jù)，以探討VEGF對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性收集2012年11月—2021年1月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理診斷確診為DLBCL的患者共203例?；颊呔鶠槌踉\，具有明確病理診斷，且通過查體、手術(shù)或影像學(xué)檢查確定腫瘤侵犯部位，采用Ann Arbor分期系統(tǒng)，每例均登記臨床資料，包括性別、年齡、臨床分期、IPI，乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和白蛋白(albumin，Alb)等指標(biāo)。并通過胸腹部CT平掃、B超定位明確患者有無肝、脾、淺表淋巴結(jié)腫大，同時收集患者免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果，如MYC、BCL-2、BCL-6、細胞起源(GCB/Non-GCB)和Ki-67等。

1.2 實驗方法收集患者外周血樣3 ml于EDTA抗凝管中，所有樣品在3 500 r/min離心10 min，取出分離血清采用酶聯(lián)吸附法進行VEGF水平測定，根據(jù)制造商使用說明，使用VEGF ELISA試劑盒(北京健平金星生物科技有限公司)測定血清VEGF水平。用BIOBASE全自動酶免工作站(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)進行雙波長進行測定，依據(jù)校準(zhǔn)品測量值與濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度，參考值范圍為0.00～142.2 pg/ml。

1.3 隨訪通過查閱患者電子病歷及紙質(zhì)病史記錄，確認患者住院治療情況，對患者進行電話隨訪，隨訪時間截至2021年7月15日?？偵嫫?overall survival，OS)定義為患者確診DLBCL到任何原因死亡或隨訪結(jié)束之間的時間間隔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料采用n(%)表示，組間比較采用Pearson χ2檢驗。對連續(xù)變量采用基于MaxStat統(tǒng)計量的方法，以確定其最佳截斷值(cut-off)。預(yù)后分析采用Kaplan-Meier曲線，組間比較使用Log-rank檢驗，采用Cox比例風(fēng)險模型進行單因素、多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計分析采用SPSS和R軟件。

2 結(jié)果

2.1 一般資料203例患者中男性104例(51.2%)，女性99例(48.8%)，年齡14～87(58.25±13.42)歲，98例患者超過60歲，LDH升高90例(44.3%)，Ann Arbor分期Ⅲ/Ⅳ期97例(47.8%)，38例患者的Ki-67≥90%，27例(13.3%)患者中樞受累，CD5陽性患者43例，患者的基線特征如表1所示。

表1 203例DLBCL患者一般資料

2.2 生存分析截止至隨訪結(jié)束時，死亡67例(33.0%)，病人的中位隨訪時間為37.6個月(95%CI：35.712～39.555)，5年OS為62%，患者的生存概率曲線如圖1所示。

圖1 203例DLBCL患者的生存曲線圖

對兩組患者臨床表現(xiàn)及實驗室檢查數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，Mann-Whitney U檢驗結(jié)果表明VEGF、年齡、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板、白蛋白、β2-MG、LDH和纖維蛋白原在存活組與死亡組之間的數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。Pearson 2結(jié)果表明BCL-2、中樞受累、肝脾腫大、Ann Arbor分期、ECOG評分和IPI評分組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，大包塊、CD5、BCL-6和骨髓受累組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 VEGF及其它連續(xù)變量的最佳截斷值的確定基于MaxStat統(tǒng)計量(圖2)計算出VEGF、白蛋白、β2-MG、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、乳酸脫氫酶和年齡的最佳截斷值分別為266.8 pg/ml、40.6 g/L、1 708 μg/L、3.82×1012/L、103 g/L、668 U/L和57歲。

2.4 生存分析

2.4.1單因素、多因素分析 單因素分析表明DLBCL的預(yù)后受多種因素的影響：VEGF、紅細胞計數(shù)、Alb、ECOG評分、血紅蛋白、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG、B癥狀、中樞受累、年齡、大包塊和BCL-2(P<0.05)。將上述變量引入Cox模型采用向前逐步法進行多因素分析，結(jié)果表明VEGF、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和白蛋白是預(yù)后的獨立影響因素(表3)。

表2 計量資料組間差異Mann-Whitney U檢驗

圖2 基于MaxStat統(tǒng)計量獲得患者VEGF的最佳截斷值

表3 DLBCL患者預(yù)后影響因素分析

2.4.2VEGF和臨床病理特征的相關(guān)分析 課題組分析了VEGF水平和臨床病理的相關(guān)性，結(jié)果表明VEGF較高的患者伴有更高的Ann Arbor分期、ECOG評分、IPI得分、BCL-2陽性和MYC陽性表達(P<0.05)，但在細胞起源和BCL-6表達中未見差異(表4)。

進一步分析不同VEGF水平的患者在Ann Arbor分期、ECOG評分、IPI不同風(fēng)險組、BCL-2和MYC表達中的生存情況。結(jié)果表明，在總體患者中VEGF<268.8時患者的生存情況較好，低VEGF的患者5年OS為65.5%，而高水平的VEGF患者5年OS僅為38.7%(圖3A)。此外，Ann Arbor分期中Ⅲ/Ⅵ期，ECOG<2分，IPI低危組，BCL-2陰性表達和MYC陽性表達組中的低VEGF水平患者的生存結(jié)局較好(圖3B～F)。

圖3 不同水平的VEGF患者組間生存分析

表4 不同VEGF水平和臨床病理的組間差異分析[n(%)]

3 討論

VEGF是1999年Gerber et al[5-6]從牛垂體星狀細胞外分離而成的一種糖蛋白，具有刺激內(nèi)皮細胞分裂、增生、促進內(nèi)皮細胞移行和增強血管通透性等生物學(xué)效應(yīng)。VEGF可通過旁分泌作用于內(nèi)皮細胞上的VEGF受體(VEGFR)，還可通過自分泌與腫瘤細胞上的VEGFR結(jié)合促進腫瘤細胞增殖，同時抑制其凋亡，在實體腫瘤血管生成及腫瘤細胞遷移、侵襲等方面均發(fā)揮重要作用[7]。DLBCL由于其具有高度的侵襲性與異質(zhì)性，患者的臨床表現(xiàn)、腫瘤的病理形態(tài)及生物學(xué)特征等存在巨大差異且預(yù)后效果差異很大[8]。近幾年，關(guān)于血管再生與相關(guān)腫瘤疾病的研究取得了一定的進展，且血管生成對于腫瘤的惡變、生長、轉(zhuǎn)移等方面至關(guān)重要，其中有研究[9]顯示，VEGF水平的高表達與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)。本回顧性研究通過分析203例初診DLBCL患者的臨床數(shù)據(jù)，表明VEGF水平是DLBCL患者的獨立預(yù)后因素，VEGF水平升高的患者生存情況明顯較差。

VEGF參與生理性血管發(fā)育，其在不同的病種中表達水平存在差異，基于實驗室ELISA法測定VEGF的參考范圍為0.00～142.2 pg/ml，本研究基于MaxStat計算出VEGF在DLBCL中的最佳截斷值為266.8 pg/ml，且VEGF<268.8 pg/ml的患者生存情況明顯高于VEGF水平增高的患者。此外分析表明存活組與死亡組患者的VEGF水平比較也存在差異，死亡組患者的VEGF水平高于存活組患者的VEGF，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，存活組與死亡組DLBCL患者之間的年齡、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板、白蛋白、β2-微球蛋白、LDH、纖維蛋白原、BCL-2陽性表達、中樞受累、肝脾腫大、Ann Arbor分期、ECOG評分和IPI評分組間也同樣存在差異。

本研究結(jié)果表明，高水平的VEGF是DLBCL患者的獨立不良預(yù)后因素，此外多因素分析提示紅細胞計數(shù)、白蛋白過低，血紅蛋白過高，年齡較大的患者預(yù)后情況較差，這與先前的研究結(jié)果基本一致[10-12]。DLBCL的臨床病理有著顯著的特異性，先前的研究[8,13]表明生發(fā)中心起源的患者預(yù)后情況優(yōu)于非生發(fā)中心起源的患者，CD5陽性表達的DLBCL患者預(yù)后情況較差。本研究中進一步分析VEGF水平與臨床病理的相關(guān)性，VEGF較高的患者伴有更高的Ann Arbor分期、ECOG評分、IPI積分、BCL-2陽性和MYC陽性表達。KM分析表明Ann Arbor分期中Ⅲ/Ⅵ期、ECOG<2分、BCL-2陰性表達和MYC陽性表達組中的低VEGF水平患者的生存結(jié)局均較好。此外，本研究進一步證實了課題組之前的一項小樣本研究結(jié)果，VEGF可以對IPI評分中低危組患者的生存情況進行更加精細的劃分[14]。

綜上所述，這項回顧性的臨床研究證實了治療前的VEGF水平與DLBCL患者的預(yù)后有關(guān)，并且確定了影響DLBCL預(yù)后的VEGF的最佳截斷值，基于該截斷值，可以對不同的細胞起源、IPI、ECOG、BCL-2陰性表達組患者再分層，證明了高水平的VEGF對DLBCL預(yù)后的影響。但本研究為單中心、回顧性分析，尚需開展前瞻性、多中心臨床研究以探討VEGF水平在DLBCL預(yù)后判斷中的作用。