吳 偉，程 龍，王 杰，楊傳蕾，尚玉強(qiáng)

作者單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 430000

血管鈣化(vascular calcification，VC)是動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎病、糖尿病、高血壓、絕經(jīng)后綜合征、動(dòng)脈狹窄和老年患者的常見病理表現(xiàn)[1]。VC的病理異常是導(dǎo)致心血管發(fā)病率和病死率高的重要因素之一[2-3]。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)為腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，主要作用是抑制破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)破骨細(xì)胞調(diào)亡，細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)能夠與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化和活化形成成熟的破骨細(xì)胞[4-5]。大量的研究表明VC主要表現(xiàn)為血管平滑肌(vascular smooth muscle cell，VSMC)發(fā)生向成骨細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化過程，目前的研究[6-7]認(rèn)為OPG/RANKL/RANK在血管壁平滑肌細(xì)胞收縮表型向成骨表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種由349個(gè)氨基酸組成，分子量為34～38 ku的富含半胱氨酸的分泌肽。有研究[8]表明，CTGF可促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG分泌，并抑制RANKL的表達(dá)，提示CTGF可能間接抑制成熟破骨細(xì)胞活化的作用。但是CTGF是否在血管鈣化過程中能夠通過調(diào)控OPG/RANK/RANKL信號通路來影響疾病發(fā)生的進(jìn)展需要進(jìn)一步的研究。因此，該研究通過沉默細(xì)胞中CTGF基因，構(gòu)建體外血管鈣化模型，驗(yàn)證血管鈣化過程中CTGF對OPG/RANK/RANKL信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌A7r5來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清購自天津TBD公司；Opti-MEM和DMEM購自美國Gibco公司；CaCl2和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽購自美國sigma公司；LipofectamineTMRNAiMAX購自美國Invitrogen公司；茜素紅法鈣質(zhì)染色試劑盒購自上海歌凡生物技術(shù)有限公司；Boldine和AR234960購自美國MCE公司；堿性磷酸酶測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Ambion公司。SYBR FAST qPCR Master Mix購自美國KAPA Biosystems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京solarbio公司；LBS#111112100 CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國LabServTM公司；BM-38XD倒置熒光顯微鏡購自上海析域儀器設(shè)備有限公司；CFX-Connect 96熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad公司；AMR-100酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的A7r5細(xì)胞從液氮罐中取出，在37 ℃水浴中完全融化后，將細(xì)胞懸液吸至離心管中，加入4 ml完全培養(yǎng)基(90%DMEM+10%FBS)，1 337 r/min離心3 min，棄上清液，細(xì)胞重新懸浮于1 ml培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入4 ml完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測轉(zhuǎn)染前24 h，將5×105個(gè)細(xì)胞重懸于1.5 ml完全培養(yǎng)基中。分別取100 pmol siRNA和5 μl Lipofectamine?RNAiMAX稀釋于250 μl Opti-MEM中，輕輕吹吸5次混勻，室溫下靜置5 min。兩種稀釋液混勻后室溫孵育20 min。將500 μl混合物加到含有細(xì)胞和1.5 ml新鮮完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，最后將細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染4 h后換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)入基因CTGF的表達(dá)情況。

1.4 細(xì)胞鈣化模型構(gòu)建及分組收集A7r5細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/ml，將1 ml細(xì)胞懸液加入12孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。鈣化培養(yǎng)基[DMEM+10 mmol/L β-甘油磷酸鹽(BGP)+3 mmol /L CaCl2]誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞鈣化，誘導(dǎo)0、12、24、48、72 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行后續(xù)檢測。為了驗(yàn)證CTGF在主動(dòng)脈血管鈣化中的作用，將實(shí)驗(yàn)分為7組。對照組：不進(jìn)行任何處理；模型組：A7r5細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化；AR234960激動(dòng)劑組：A7r5細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，AR234960激動(dòng)劑(10 μmol/L，12 h)處理；CTGF-siRNA組：A7r5細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，CTGF-siRNA轉(zhuǎn)染處理；siRNA-NC組：A7r5細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，siRNA-NC轉(zhuǎn)染處理；Boldine抑制劑組：A7r5細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，Boldine抑制劑(80 μmol/L，12 h)處理；Boldine+AR234960組：VSMC細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化后，先進(jìn)行Boldine(80 μmol/L，12 h)抑制劑處理，再進(jìn)行AR234960激動(dòng)劑(10 μmol/L，12 h)處理。

1.5 茜素紅染色將12孔板中的A7r5細(xì)胞干預(yù)后棄去上清液，各組細(xì)胞用PBS洗3次。用4%多聚甲醛固定30 min后吸去4%多聚甲醛溶液。加入2 ml茜素紅染液，室溫染色30 min，蒸餾水速洗。在倒置熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測將12孔板中的A7r5細(xì)胞干預(yù)后棄去上清液，設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管。空白管加入0.03 ml雙蒸水，測定管中加入0.03 ml樣本，標(biāo)準(zhǔn)管加入0.03 ml標(biāo)準(zhǔn)液；每管加入0.5 ml緩沖液和0.5 ml基質(zhì)液，充分混勻，37 ℃水浴15 min后加入1.5 ml顯色液；在520 nm的波長下測各管吸光度。

1.7 熒光定量qRT-PCR取1 ml的TRIzol加入細(xì)胞培養(yǎng)板中提取總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃、3 min；95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s(40 cycles)，記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔt計(jì)算mRNA的相對含量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot提取各組細(xì)胞的蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)的含量。20 μg蛋白加入凝膠中(配制12%的分離膠和5%的濃縮膠)，濃縮膠恒壓80 V 40 min,分離膠恒壓120 V 50 min。恒壓90 V轉(zhuǎn)膜50 min，5 %脫脂奶粉室溫封閉 4 ℃過夜，加入一抗(CTGF 1 ∶500；GAPDH 1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜后二抗(Goat anti-Rabbit IgG 1 ∶10 000)室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液后置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鈣化模型構(gòu)建茜素紅染色結(jié)果顯示如圖1，鈣化模型誘導(dǎo)12 h后能夠看到少量橘紅色的鈣化結(jié)節(jié)(圖中細(xì)胞外的紅色可能是由于細(xì)胞鈣化時(shí)添加的CaCl2未清洗干凈造成的)，鈣化模型誘導(dǎo)時(shí)間為48 h時(shí)，鈣化結(jié)節(jié)增多，而誘導(dǎo)時(shí)間為72 h時(shí)，鈣化誘導(dǎo)過度，產(chǎn)生的鈣化結(jié)節(jié)過多。因此鈣化模型誘導(dǎo)的最佳時(shí)間為48 h。

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CTGF表達(dá)水平檢測結(jié)果轉(zhuǎn)染CTGF-siRNA表達(dá)質(zhì)粒后，與對照組比較，陰性對照組A7r5細(xì)胞中CTGF相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CTGF-siRNA-1、，CTGF-siRNA-2和CTGF-siRNA-3組A7r5細(xì)胞中CTGF相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如表2。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒后能有效降低CTGF的表達(dá)量。

圖1 A7r5細(xì)胞的鈣化表達(dá)情況 茜素紅×200

圖2 CTGF-siRNA對細(xì)胞鈣化的影響 茜素紅×200

表2 CTGF-siRNA和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CTGF的表達(dá)水平(n=3)

2.3 CTGF-siRNA對細(xì)胞鈣化的影響由圖2可知，與模型組相比，siRNA-NC組鈣化結(jié)節(jié)的量基本沒有變化，CTGF-siRNA、AR234960 + Boldine和Boldine抑制組的鈣化結(jié)節(jié)減少，AR234960激動(dòng)劑組的鈣化結(jié)節(jié)增多。

2.4 CTGF-siRNA對細(xì)胞的ALP活性影響ALP活性測定結(jié)果顯示如圖3(F=204.3)，與模型組相比，siRNA-NC組ALP的活性基本沒有變化，CTGF-siRNA組，AR234960+Boldine組和Boldine抑制組的ALP的活性降低(P<0.05)，AR234960激動(dòng)劑組的ALP的活性升高(P<0.05)。

圖3 A7r5細(xì)胞中的ALP活性

2.5 CTGF-siRNA對細(xì)胞中OPG、RANK、RANKL表達(dá)的影響由表3可知，與模型組相比，siRNA-NC組OPG、RANK、RANKL的表達(dá)量基本沒有變化，CTGF-siRNA、AR234960+Boldine和Boldine抑制組的CTGF、RANK、RANKL的表達(dá)量降低(P<0.05)，OPG表達(dá)量升高(P<0.05)。AR234960激動(dòng)劑組 CTGF、RANK、RANKL的表達(dá)量升高(P<0.05)，OPG表達(dá)量降低(P<0.05)。

表3 A7r5細(xì)胞中CTGF、OPG、RANK和RANKL的表達(dá)水平

3 討論

VC是指在血管中以磷酸鈣復(fù)合物的形式沉積的礦物，近年來的研究[9-10]表明，VC與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病腎病、心肌梗死等多種疾病密切相關(guān)，是心血管疾病高發(fā)病率和高病死率的重要原因。隨著我國人口老齡化趨勢的加重和人們生活水平的提高，血管鈣化的發(fā)生率也在逐漸提高，與其相關(guān)的許多心血管疾病已嚴(yán)重危害到人類的健康。血管鈣化是一種與骨發(fā)育類似的主動(dòng)的、可預(yù)防和可逆轉(zhuǎn)的高度可調(diào)控的生物學(xué)過程，因此，研究血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展及其發(fā)病機(jī)制，為血管鈣化的有效防治具有重要臨床意義。本研究按照已報(bào)道的鈣化模型[11]，即采用10 mmol/L β-甘油磷酸鹽(BGP)和3 mmol/L CaCl2誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞鈣化，證明了沉默CTGF能夠減少A7r5細(xì)胞的鈣化。

ALP是一種在堿性條件下能夠分解磷酸二甲苯生成游離的酚和磷酸，廣泛分布于人體骨骼、腸、腎和胎盤等組織。它能夠通過調(diào)節(jié)礦化抑制劑PPi的水平來促進(jìn)血管鈣化，目前已被證明是血管鈣化病理生理焦磷酸途徑中的一個(gè)具有促進(jìn)作用的因子[12]。有研究[13]表明，血清中ALP水平與冠狀動(dòng)脈鈣化和斑塊易損性具有相關(guān)性。并且有研究[14]表明ALP是血清中膠原蛋白鈣化所必需的因子。因此，降低ALP的活性能夠有效預(yù)防血管鈣化的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)顯示CTGF-siRNA能夠有效降低ALP的活性。

OPG/RANK/RANKL信號通路在調(diào)控成骨細(xì)胞形成及骨重建中發(fā)揮重要作用。OPG 通過與 RANKL 結(jié)合，阻斷 RANK 與其結(jié)合，從而抑制骨吸收，維持骨代謝平衡[15]。課題組在實(shí)驗(yàn)中使用腺病毒轉(zhuǎn)染A7r5使CTGF基因沉默，顯示RANK、RANKL基因水平降低，OPG基因水平上升，說明沉默CTGF基因能夠通過調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL信號通路從而減輕細(xì)胞鈣化程度。同時(shí)， Liu et al[16]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯能夠通過調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL抑制血管平滑肌的成骨分化，有效防止VSMCs從收縮型到成骨表型的表型轉(zhuǎn)換過程，進(jìn)而影響細(xì)胞鈣化的形成。為了進(jìn)一步明確上述猜測，本研究使用OPG/RANK/RANKL信號通路的激動(dòng)劑(AR234960)和抑制劑(Boldine)干預(yù)，測定OPG/RANK/RANKL信號通路對細(xì)胞鈣化的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入AR234960后，RANK和RANKL基因水平上升，OPG基因水平下降，細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)增多。但加入Boldine后，RANK和RANKL基因水平下降，OPG基因水平上升，細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)減少，這說明沉默CTGF基因與Boldine有相同的作用，進(jìn)一步證明了CTGF基因是通過調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL信號通路從而達(dá)到抑制細(xì)胞鈣化的目的。

綜上所述，本研究成功建立了A7r5細(xì)胞的鈣化模型，通過實(shí)驗(yàn)確定沉默CTGF基因能夠減輕血管平滑肌的鈣化程度，降低ALP活性，調(diào)控OPG/RANK/RANKL信號通路，從而抑制主動(dòng)脈血管鈣化的進(jìn)展，為血管鈣化的治療提供了新的靶點(diǎn)。