王鶴鳴，劉 周，王珊珊，唐 偉，周 強(qiáng)

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230601

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染最常見的革蘭陰性菌，檢出率分別可達(dá)6.8%和6.69%[1]。KP根據(jù)毒力特點(diǎn)可分為經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicK.pneumoniae，cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentK.pneumoniae，hvKP)。hvKP的毒力顯著高于cKP，它可以侵害健康的年輕個(gè)體，致死率達(dá)3%～32%[2]。目前研究多將莢膜多糖合成相關(guān)基因≥2個(gè)陽性或鐵載體相關(guān)基因≥3個(gè)陽性的KP菌株定義為hvKP[3]。肺上皮細(xì)胞可以分泌Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)[4]、細(xì)胞因子等以應(yīng)對肺炎克雷伯菌肺炎(K.pneumoniaepneumonia，KPN)。TLRs接收相關(guān)微生物配體信號并啟動下游級聯(lián)反應(yīng)，其中TLR4參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，但可能引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)[5]。該研究擬通過分析臨床菌株毒力基因等流行病學(xué)特征，進(jìn)而闡明hvKP及cKP感染的患者體內(nèi)或細(xì)胞水平TLR4的表達(dá)水平及其與臨床預(yù)后的差異，為KPN的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選取2020年10月—2021年10月間安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的85例KPN患者，并收集同期收治的55例體檢健康者作為對照。收集培養(yǎng)出的KP菌株65株，并收集檢出KP患者的血清與臨床病歷資料。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 符合《中國成人社區(qū)獲得性肺炎臨床實(shí)踐指南》[6-7]，在痰培養(yǎng)或肺泡灌洗液中檢出KP，外周血檢查:白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞以及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)增高；結(jié)合患者X線或CT檢查，明確診斷為KPN。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 全自動細(xì)菌分析儀(法國Biomerieux公司)；生物安全柜(力新儀器上海有限公司)；細(xì)菌多點(diǎn)接種儀(法國Interscience公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀器(德國Bi-ometra公司)；凝膠成像儀(北京大龍有限公司)；PCR引物(上海生工生物公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物有限公司)，人肺泡上皮細(xì)胞A549來自中國科學(xué)院(上海)。

1.2 方法

1.2.1毒力基因檢測 用煮沸法提取各菌株的DNA，采用PCR方法檢測8種毒力基因[8]，包括：①莢膜多糖合成和調(diào)控相關(guān)基因rmpA1、rmpA2、magA；②鐵載體系統(tǒng)相關(guān)基因iucA、kfu、iroN、iroB；③菌毛合成相關(guān)基因mrkD[5-6]。毒力基因的引物序列參照表1。各菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后記錄結(jié)果并進(jìn)行比對。

表1 KP毒力基因的PCR引物序列

1.2.2藥敏試驗(yàn) 敏感與耐藥判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S26文件2018年推出的判讀標(biāo)準(zhǔn)[9]。采用瓊脂平板稀釋法測定菌株對于15種常用抗菌藥物的最低抑菌濃度。

1.2.3ELISA實(shí)驗(yàn) 收集患者外周血清，通過毒力基因檢測將實(shí)驗(yàn)對象分為cKP組與hvKP組，健康體檢者血清作為健康對照組，采用ELISA方法測定兩實(shí)驗(yàn)組及對照組外周血清TLR4的表達(dá)水平，檢測過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書及儀器操作指南進(jìn)行。

1.2.4KP侵染A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞用含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%密度時(shí)，鋪12孔板，更換為不含雙抗的培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)將臨床培養(yǎng)鑒定出的hvKP、cKP兩種菌株，分別于哥倫比亞血瓊脂平板上過夜生長后，刮取單個(gè)菌落于LB培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱中搖動培養(yǎng)，分光光度計(jì)測量600 nm吸光度=0.35，此時(shí)細(xì)菌處于生長指數(shù)期，10 000 r/min離心15min，無菌生理鹽水清洗重懸，通過稀釋涂板法計(jì)菌落數(shù)量，在A549細(xì)胞12孔板中，每孔加入4 μl菌液，測得MOI=100 ∶1。

1.2.5qRT-PCR 在12孔板中使用hvKP、cKP分別侵染A549細(xì)胞，設(shè)立未感染的空白細(xì)胞為對照組，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA，TLR4引物序列：上游5′-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3′，下游5′-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3′。在10 μl反應(yīng)體系中使用1 μl總RNA進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法，通過計(jì)算與內(nèi)參基因GAPDH比值來確定目的基因的表達(dá)水平。每組重實(shí)驗(yàn)復(fù)3次。

1.2.6臨床嚴(yán)重程度及預(yù)后評分 根據(jù)醫(yī)院病歷系統(tǒng)獲取病人基本信息與臨床特征如年齡、體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓、PH、血尿素氮、血糖、血鈉、紅細(xì)胞比積、氧分壓及相關(guān)影像學(xué)表現(xiàn)等，根據(jù)臨床PSI評分[10]及CURB-65評分[11]對KPN患者進(jìn)行分級，分析患者血清TLR4水平與臨床肺炎評分之間的相關(guān)性。本研究已獲安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因檢測結(jié)果hvKP組中毒力基因陽性率最高的前3種為：kfu(100%)，rmpA1(87.8%)，rmpA2(80.5%)。與cKP組相比，毒力基因有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的是rmpA1(P=0.000)，rmpA2(P=0.000)，magA(P=0.000)，ironB(P=0.000)。其他基因雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在hvKP組中的陽性率均高于cKP組(表2)。hvKP及cKP基因電泳條帶結(jié)果見圖1。

表2 hvKP和cKP的毒力基因比較[n(%)]

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果藥敏結(jié)果顯示本院所收集肺炎克雷伯桿菌對替加環(huán)素最敏感，敏感率為97.6%；其次是阿米卡星和阿莫西林/克拉維酸，敏感率分別為80.0%及72.9%。在hvKP中對替加環(huán)素最敏感，敏感率為95.1%。cKP的頭孢曲松、厄他培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性明顯高于hvKP(表3)。

表3 hvKP和cKP的抗生素敏感性比較[n(%)]

圖1 KP毒力基因電泳條帶結(jié)果

2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過對KP菌株毒力基因檢測，將收集的臨床血清分為hvKP組及cKP組。血清TLR4的ELISA結(jié)果顯示，相比cKP組，hvKP組的血清TLR4水平明顯高于健康對照組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果qRT-PCR法檢測顯示，相比于空白細(xì)胞對照，在hvKP侵染6 h后的A549細(xì)胞中，TLR4的mRNA表達(dá)水平明顯升高，而在cKP侵染的細(xì)胞中TLR4升高不明顯(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 臨床肺炎評分預(yù)后分析對KPN患者根據(jù)臨床肺炎評分進(jìn)行分級后，結(jié)果顯示患者血清TLR4水平與PSI評分呈正相關(guān)性，PSI評分越高的患者，血清TLR4水平也越高(圖4A)；在CURB-65評分中，2分的患者血清TLR4水平高于0～1分的患者(圖4B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。應(yīng)用Spearman相關(guān)分析表示，血清TLR4水平與PSI、CURB評分均存在正相關(guān)關(guān)系(r：0.692、0.466；P<0.001)。

圖2 hvKP、cKP感染的患者及健康體檢組血清中TLR4的表達(dá)量

圖3 TLR4在mRNA水平上的表達(dá)

圖4 血清TLR4水平與各肺炎評分的相關(guān)性

3 討論

KP是與人類關(guān)系密切的一種機(jī)會性致病菌[12]，在免疫功能低下的人群中通過鐵攝取系統(tǒng)、CPS、LPS等多種毒力因子，可以引起以呼吸道為主的多部位的感染。目前，治療KP感染的常用藥物有碳青霉烯類(例如亞胺培南，美羅培南)、內(nèi)酰胺類及喹諾酮類等，但近年來KP的耐藥率逐漸升高[13]。此外，hvKP感染的發(fā)病率和病死率也存在持續(xù)上升趨勢，并且目前hvKP的明確診斷主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)及基因檢測，需要較長的時(shí)間，給臨床治療也帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。hvKP可產(chǎn)生大量的莢膜多糖，并且擁有較強(qiáng)的抗吞噬作用以及抗殺菌作用，可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及加重感染。莢膜多糖是hvKP重要的毒力因子，主要通過抗巨噬細(xì)胞吞噬作用、抵抗抗菌肽等作用從而幫助細(xì)菌免疫逃逸[4]。目前hvKP的分子標(biāo)志物診斷仍存在爭議，本研究通過對收集的臨床菌株的毒力基因檢測，顯示rmpA1、rmpA2及magA基因聯(lián)合診斷hvKP的特異性及準(zhǔn)確性較高，可作為臨床hvKP檢測的重要分子標(biāo)志物。

從呼吸道快速清除入侵細(xì)菌對于有效的宿主防御機(jī)制對抗細(xì)菌性肺炎具有重要意義。除了直接的細(xì)菌吞噬和殺傷外，肺上皮細(xì)胞表面的TLR4識別病原菌后，可以趨化并刺激中性粒細(xì)胞等，激活免疫反應(yīng)[14]，并促進(jìn)CRP等的分泌，TLR4水平的上升并不是單獨(dú)的，與機(jī)體的炎性反應(yīng)有密切的關(guān)聯(lián)。本研究證實(shí)hvKP侵染的人肺泡上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平明顯上升，提示肺上皮細(xì)胞對hvKP的感染做出反應(yīng)并過表達(dá)TLR4介導(dǎo)免疫反應(yīng)等對抗感染。

通過對KPN患者血清中TLR4水平的檢測，顯示與hvKP感染的患者TLR4水平相比，cKP感染的患者及健康體檢者有明顯的升高，提示TLR4可能在毒力基因的介導(dǎo)下參與了hvKP菌株感染人體的防御過程。根據(jù)對患者臨床預(yù)后的肺炎評分分級，結(jié)果顯示血清TLR4水平與PSI評分及CURB-65評分呈正相關(guān)性，TLR4水平越高的患者由評分預(yù)測的臨床預(yù)后情況越差，提示TLR4可作為衡量患者體內(nèi)的病程進(jìn)展程度的指標(biāo)，血清TLR4水平可能作為hvKP感染的患者診斷和評估預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。并且猜測，通過抑制TLR4可以減輕機(jī)體由于炎癥反應(yīng)帶來的損傷，但需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究毒力基因與蛋白通路之間的聯(lián)系以及起到保護(hù)作用的機(jī)制。