張晶，安秀英，胡鋒超

食管鱗狀細(xì)胞癌是發(fā)生在食管鱗狀上皮的一種惡性腫瘤，病死率高，據(jù)統(tǒng)計，食管癌根治性手術(shù)治療后，局部復(fù)發(fā)率仍在25%～60%［1-2］。目前，組織分化程度和TNM分期是臨床醫(yī)師判斷食管鱗狀細(xì)胞癌病人預(yù)后的主要指標(biāo)，但臨床常有預(yù)后與分期不符的現(xiàn)象［3-4］。因此，在分子水平上尋找敏感、特異的預(yù)后指標(biāo)，提供個體化的預(yù)后信息，具有重要的臨床意義。為了提高病人生存質(zhì)量和生存時間，改善病人預(yù)后，尋找與食管鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物非常重要。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的特異性最高、作用最強(qiáng)的血管生長因子，其主要家族成員為血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），生物學(xué)作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成和增加血管的通透性，參與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展［5-6］。微小核糖核酸-200b-3p（microRNA-200b-3p，miR-200b-3p）屬于微小核糖核酸（microRNA，miRNA），可參與細(xì)胞分化、代謝等生理病理過程。研究發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p可通過靶向下調(diào)VEGFA表達(dá)，在胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移等過程中發(fā)揮抑制作用［7］。但二者是否共同參與食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，目前尚不清楚。因此，本研究通過檢測食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)，并結(jié)合臨床病理特征及隨訪資料，分析二者表達(dá)與病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為制定個體化治療策略及改善食管鱗狀細(xì)胞癌病人預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2013年12月至2015年12月在河北省退役軍人總醫(yī)院接受手術(shù)切除且經(jīng)組織病理證實的95例食管鱗狀細(xì)胞癌病人為研究對象，收集食管鱗狀細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織（距癌組織＞5 cm，經(jīng)HE染色顯示無癌細(xì)胞浸潤）。其中男性48例，女性47例；年齡（63.61±3.70）歲；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［8］ⅠA～ⅡB期14例，ⅢA～ⅣA期81例；浸潤深度T1～T2期28例，T3～T4期67例；腫瘤高分化15例，中低分化80例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病人在術(shù)前均為初治，均未有放化療等抗腫瘤治療且無手術(shù)禁忌；病人經(jīng)病理診斷證實為食管鱗狀細(xì)胞癌；均為R0切除病人；資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理證實為高級別上皮內(nèi)瘤變的病人；合并有其他惡性腫瘤者；合并患有心臟病、肝病、高血壓等疾病者；隨訪資料缺失。

1.2 方法

1.2.1 miR-200b-3p、VEGFA mRNA表 達(dá) 情 況 檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測各組織中miR-200b-3p、VEGFA mRNA表達(dá)，按照TRIzoI試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）提取食管鱗狀細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。miR-200b-3p正向引物：5'-GCCGCTAATACTGCCTGGTAATG-3'，反 向 引 物 ：5'-GTGCAGGGTTCCGAGGT-3'；內(nèi) 參U6正 向 引 物 ：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。VEGFA mRNA正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物：5'-AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3'；內(nèi) 參GAPDH正向引物：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃、5 min，95℃、30 s，60℃、30 s，一共進(jìn)行40個循環(huán)。重復(fù)3次，miR-200b-3p、VEGFA mRNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCt公式進(jìn)行計算。本研究以miR-200b-3p相對表達(dá)量＜均值者45例為低表達(dá)，≥均值者50例為高表達(dá)。

1.2.2 VEGFA表達(dá)情況檢測 采用免疫組化法檢測各組織中VEGFA表達(dá)情況。各組織標(biāo)本固定后，石蠟包埋、切片，厚度約4 μm，展片后于60℃烘烤1 h；切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化；然后石蠟切片采用枸櫞酸鈉緩沖液煮沸18 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)；再滴加3%過氧化氫于室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；而后經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3 min×3次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min封閉非特異性結(jié)合位點；吸棄封閉液（陰性對照除外），然后滴加兔抗人VEGFA抗體，置于4℃冰箱過夜；取出切片經(jīng)PBS沖洗5 min×3次，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育40 min；再經(jīng)PBS沖洗切片5 min×3次，DAB顯色，10%蘇木素進(jìn)行復(fù)染；將切片置入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 免疫組化染色結(jié)果判定［9］每張染色切片結(jié)果均由兩名病理醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判定。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性顯色。VEGFA由染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比來進(jìn)行評分。①細(xì)胞染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分（無染色），1分（弱陽性，淺黃色），2分（中陽性，棕黃色），3分（強(qiáng)陽性，棕褐色）。②陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：0分（陽性細(xì)胞數(shù)＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比評分乘積為染色指數(shù)（staining index，SI），SI＜3分為陰性，SI=3為弱陽性，3＜SI＜6為中陽性，SI≥6為強(qiáng)陽性。本研究以陰性和弱陽性為低表達(dá)，以中陽性和強(qiáng)陽性為高表達(dá)。

1.2.4 隨訪 所有病人均有完整的隨訪資料，對所有治療出院后的病人進(jìn)行復(fù)查或電話隨訪，每月1次，隨訪時間為5年，末次隨訪時間截至2020年12月31日，統(tǒng)計并記錄病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。隨訪期間，發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移42例（復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組）、未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人53例（非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；計量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗或校正t檢驗。采用Pearson檢驗分析食管鱗狀細(xì)胞癌病人miR-200b-3p與VEGFA mRNA表達(dá)的相關(guān)關(guān)系；采用Kaplan-Meier法分析食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)情況比較食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05）；VEGFA mRNA和VEGFA陽性率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)情況

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌病人miR-200b-3p與VEGFA mRNA表達(dá)的相關(guān)性食管鱗狀細(xì)胞癌病人miR-200b-3p與VEGFA mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.39，P＜0.001）。見圖2。

圖2 食管鱗狀細(xì)胞癌病人miR-200b-3p與VEGFA mRNA表達(dá)相關(guān)性

2.3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組病人食管鱗狀細(xì)胞癌組織miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)情況比較復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組病人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p表達(dá)水平（0.53±0.14）明顯低于非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組（0.78±0.20）（t=6.87，P＜0.001），VEGFA陽性率［92.86%（39/42）］明顯高于非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組［67.92%（36/53）］（χ2=8.76，P＜0.05）。

2.4 miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與病人年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度無關(guān)（P＞0.05），與病人組織分化程度、TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例（%）

2.5 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系95例食管鱗狀細(xì)胞癌病人5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為44.21%（42/95）。Kaplan-Meier曲線顯示，miR-200b-3p低表達(dá)者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率（55.56%）明顯高于高表達(dá)者（34.00%）（χ2=4.46，P=0.035）；VEGFA高表達(dá)者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率（55.17%）明顯高于低表達(dá)者（27.03%）（χ2=7.26，P=0.007）。見圖3。

圖3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p、VEGFA表達(dá)與病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.6 影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素單因素分析顯示，組織分化程度、TNM分期、miR-200b-3p低表達(dá)、VEGFA高表達(dá)均是影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素（P＜0.05）。多因素分析顯示，組織分化程度、miR-200b-3p低表達(dá)、VEGFA高表達(dá)是影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素分析

3 討論

食管癌是一種常見的、病死率高的惡性腫瘤，對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。我國食管癌死亡率位居第4位，其中90%是食管鱗狀細(xì)胞癌，5年相對生存率低于40%。目前，組織分化程度和TNM分期是臨床醫(yī)師判斷食管鱗狀細(xì)胞癌病人預(yù)后的主要指標(biāo)，但據(jù)不完全統(tǒng)計，當(dāng)前約60%的病人臨床分期與術(shù)后病理分期不符，存在一定的局限性［10］。因此尋找敏感、特異的分子預(yù)后指標(biāo)，針對不同病人選擇合適的個體化治療方案，能提高遠(yuǎn)期生存率，同時還保證病人有較高的生活質(zhì)量，對于臨床及科學(xué)研究工作都有重大意義［11］。

VEGFA作為一種重要的血管新生誘導(dǎo)劑，主要生物學(xué)作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成和增加血管的通透性，引起腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致放療的失?。?2］。孫文澤等［13］研究表明，VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)。翁小坤等［14］研究表明，下調(diào)VEGFA對食管癌細(xì)胞增殖有抑制作用。此外，Shen等［15］研究指出，肌動蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1下調(diào)通過調(diào)控miR-498/VEGFA軸阻礙食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移，可作為診斷和治療食管鱗狀細(xì)胞癌的新型生物標(biāo)志物。但VEGFA與食管鱗狀細(xì)胞癌病人預(yù)后的關(guān)系研究較少。本研究結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VEGFA mRNA和VEGFA陽性率遠(yuǎn)高于癌旁正常組織，其表達(dá)與病人組織分化程度、TNM分期有關(guān)，提示VEGFA可能與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組病人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VEGFA陽性率遠(yuǎn)高于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，且Kaplan-Meier曲線顯示VEGFA高表達(dá)者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率遠(yuǎn)高于低表達(dá)者，提示VEGFA可能與食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系，其高表達(dá)可能對病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的提示作用。此外，Cox分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA高表達(dá)是影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，提示檢測VEGFA可能有利于判斷食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

miRNA是一種非編碼RNA，其主要作用是在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移均有關(guān)［16-17］。miR-200b-3p是一種研究較多的miRNA，在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，其高表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移［18-19］。但miR-200b-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。因此，本研究采用實時熒光定量PCR法檢測組織中miR-200b-3p表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p表達(dá)水平遠(yuǎn)低于癌旁正常組織，其表達(dá)與病人組織分化程度、TNM分期有關(guān)，提示miR-200b-3p可能在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組病人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-200b-3p表達(dá)水平遠(yuǎn)低于非復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，且Kaplan-Meier曲線顯示miR-200b-3p低表達(dá)者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率遠(yuǎn)高于高表達(dá)者，提示miR-200b-3p低表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，Cox分析發(fā)現(xiàn)，miR-200b-3p低表達(dá)是影響食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，提示miR-200b-3p表達(dá)可能作為評估食管鱗狀細(xì)胞癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的參照指標(biāo)之一。

李慶賀等［7］研究報道，miR-200b-3p可通過靶向下調(diào)VEGFA表達(dá)參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展。但miR-200b-3p與VEGFA相互作用與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及病人預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究Pearson檢驗分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌病人miR-200b-3p與VEGFA mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-200b-3p可能通過調(diào)控VEGFA參與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展，具體作用機(jī)制在今后需深入探討。

綜上所述，miR-200b-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，VEGFA表達(dá)上調(diào)，二者表達(dá)與病人組織分化程度、TNM分期有關(guān)，且二者均可能作為評估病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床指標(biāo)。但miR-200b-3p、VEGFA在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的具體作用機(jī)制，后期仍需進(jìn)一步研究探討。