黃芪超微粉抗急性肝損傷、抗疲勞作用及黃芪甲苷含量的變化*

柴夢(mèng)音 寇卜心 豆雙雙 劉曉霓**

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069；2.北京肝病研究所，北京 100069)

超微粉碎技術(shù)是利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法，對(duì)固體物質(zhì)進(jìn)行撞擊和研磨，進(jìn)而克服固體物質(zhì)內(nèi)部凝聚力使之粉碎的技術(shù)，可以使物質(zhì)的粒度達(dá)到10 μm以下，甚至達(dá)到1 μm的超微米水平[1-2]。超微粉碎技術(shù)是機(jī)械化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展較快的一種高新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品、中藥及化妝品領(lǐng)域[2]。中藥超微粉是采用超微粉碎技術(shù)打破藥材細(xì)胞壁，將中藥材進(jìn)行微粉化，增強(qiáng)中藥的溶解性、吸附性和流動(dòng)性,提高中藥生物利用度、保持或提高中藥藥效，節(jié)約中藥資源，提高傳統(tǒng)中藥劑型品質(zhì)、促進(jìn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化，是促進(jìn)中藥現(xiàn)代化的重要途徑之一[3-8]。豆科植物蒙古黃芪AstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge的根，具有補(bǔ)氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌的功效[9]。現(xiàn)代藥理研究顯示黃芪具有調(diào)節(jié)脂代謝及抗氧化損傷[10]、抗衰老[11]、增強(qiáng)免疫、清除自由基活性、抗肝纖維化等[12-13]作用。

本研究采用低溫超微粉碎技術(shù)將黃芪飲片粉碎制成超微粉，采用小鼠急性肝損傷模型和游泳耐疲勞模型，評(píng)價(jià)黃芪超微粉保肝、耐疲勞的作用，并檢測(cè)黃芪超微粉的黃芪甲苷的含量變化，為黃芪超微粉的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 7600生化儀(日本日立)；DM750顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；TFCW-6B低溫振動(dòng)粉碎機(jī)(濟(jì)南天方機(jī)械有限公司)；MS2000激光粒度儀(英國(guó)馬爾文公司)；1200 series 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司)；Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑 黃芪飲片(北京燕北飲片廠)；分析純CCl4(北京化工廠)；乳酸試劑盒 (南京建成生物工程研究所)；AST和ALT測(cè)定試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)；黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-201314，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；色譜純乙腈(美國(guó)Sigma公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，5～6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0011，所有小鼠飼養(yǎng)于SPF獨(dú)立通風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(京)2020-0015。小鼠飼養(yǎng)采用12 h/12 h光照/黑暗條件，溫度20～24 ℃，自由采食和飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1黃芪超微粉制備 黃芪飲片用低溫振動(dòng)粉碎機(jī)在-25 ℃低溫條件下震動(dòng)粉碎30 min后，冷凍保存待用。采用顯微鏡和激光粒度儀觀察黃芪超微粉的顯微表征和粒度表征。

2.2黃芪甲苷含量測(cè)定

2.2.1HPLC條件 流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫(0 min，30∶70，V/V；10 min，30∶70；15 min，50∶50；18 min，60∶40；20 min，30∶70；30 min，30∶70)；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL· min-1，運(yùn)行時(shí)間：30 min，柱溫：25 ℃。ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為95 ℃，氮?dú)饬魉贋?.6 L·min-1，增益為2。

2.2.2黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 精密稱取黃芪甲苷，配制10 mL的0.5 mg·mL-1黃芪甲苷儲(chǔ)備液。取一定量黃芪甲苷儲(chǔ)備液，以流動(dòng)相稀釋，配制0.02，0.04，0.09，0.185和0.375 μg·mL-1濃度對(duì)照品溶液；每1梯度濃度溶液進(jìn)樣20 μL測(cè)定，重復(fù)1次，取平均值，以組分的峰高(A)為縱坐標(biāo)，組分濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

2.2.3黃芪超微粉樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定 取一定量黃芪飲片，研缽粉碎，稱量0.5 g加50% 乙醇至9 mL；稱量黃芪超微粉76.8 mg，加50%乙醇至4 mL；以上樣品振蕩器充分混勻后，60 ℃超聲波清洗器中加熱超聲20 min，取出重復(fù)振蕩器混勻，繼續(xù)60 ℃超聲波清洗器中加熱超聲20 min，重復(fù)3次，樣品加蓋密封過(guò)夜，次日測(cè)定樣品溶液終體積，上清液氮?dú)饬鲹]干，流動(dòng)相復(fù)溶，0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，20 μL HPLC進(jìn)樣測(cè)定黃芪甲苷含量，同一樣品測(cè)定2次。

2.3給藥劑量和方法 黃芪飲片和黃芪超微粉水煎制成干浸膏，用0.1%羧甲基纖維素鈉制成混懸液。根據(jù)小鼠最大給藥溶劑確定黃芪飲片和黃芪超微粉最大給藥劑量為10 g·kg-1。

2.4對(duì)急性肝損傷小鼠的影響 5～6周齡昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)、模型組(M)、黃芪飲片組(HQY，10 g·kg-1)、黃芪超微粉高劑量組(HQFH，10 g·kg-1)、黃芪超微粉中劑量組(HQFM，g·kg-1)、黃芪超微粉低劑量組(HQFL，0.4 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半。除對(duì)照組和模型組，各藥物組提前給治療藥7d，對(duì)照組給與相同體積生理鹽水。末次給藥后，模型組和各藥物組腹腔注射0.1% CCl4橄欖油(10 mL·kg-1)，18 h后所有小鼠眼眶采血，分離血漿，進(jìn)行肝功能指標(biāo)檢測(cè)，一部分肝臟組織固定用于HE染色觀察肝臟損傷情況。

2.5對(duì)負(fù)重游泳小鼠的影響 5～6周齡昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con)、模型組(M)、黃芪飲片組(HQY，10 g· kg-1)、黃芪超微粉高劑量組(HQFH，10 g·kg-1)、黃芪超微粉中劑量組(HQFM，2 g·kg-1)、黃芪超微粉低劑量組(HQFL，0.4 g·kg-1)，每組10只，雌雄各半。每組提前給藥7 d，將小鼠按照體重10% 負(fù)重后，將小鼠置入水中游泳(25 ℃)，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。當(dāng)小鼠沉入水中不再浮出水面5 s，停止計(jì)時(shí)，計(jì)算小鼠游泳時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠眼眶取血，檢測(cè)血中乳酸含量。對(duì)照組不進(jìn)行游泳，但給與生理鹽水，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取血檢測(cè)乳酸含量。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件多因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，P<0.05 表示為具有顯著性意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1黃芪超微粉的顯微和粒度表征 顯微鏡下可見(jiàn)黃芪飲片被粉碎成大小不等的細(xì)小顆粒，大部分顆粒小于80 μm(圖1A)。超微粉黃芪超微粉粒徑分布范圍為0.45～709 μm，D10為3.235 μm，D25為7.219 μm，D50為17.559 μm，D75為63.890 μm，D90為140.794 μm。小于80 μm的顆粒累積大于80%(圖1B)。這些結(jié)果提示，黃芪飲片經(jīng)過(guò)超低溫粉碎后大部分顆粒為超微粉的粒徑范圍，已經(jīng)超微粉化。

A.黃芪超微粉顯微表征；B.黃芪超微粉粒度表征

3.2對(duì)急性肝損傷小鼠的影響 與對(duì)照組相比，腹腔注射1% CCl4沒(méi)有造成小鼠明顯體重下降。無(wú)論是與對(duì)照組還是模型組相比，各治療組小鼠的體重變化無(wú)顯著性差異，提示小鼠對(duì)黃芪飲片和各超微粉均耐受(圖2A)。肝臟指數(shù)結(jié)果顯示：1% CCl4可以引起肝臟腫大，肝臟重量增加，與對(duì)照組相比肝臟指數(shù)增加(P<0.05)；與模型組相比，黃芪飲片和各黃芪超微粉組小鼠的肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05)，但各治療組之間無(wú)差異(圖2B)。HE結(jié)果顯示，1% CCl4可以造成小鼠急性肝損傷，鏡下可見(jiàn)成片的肝壞死灶。與模型組相比，黃芪飲片及各劑量黃芪超微粉組小鼠肝壞死明顯減少(圖 2C)；與對(duì)照組相比，模型組的AST，ALT明顯升高(P<0.05)，而黃芪飲片及各黃芪超微粉可以明顯降低CCl4所致的AST，ALT的升高(P<0.05)，提示黃芪飲片和黃芪超微粉具有保護(hù)肝損傷的作用(圖 2D)。值得研究的是，黃芪飲片和各黃芪超微粉組在保護(hù)肝損傷時(shí)沒(méi)有顯著差異，0.4 g·kg-1的小劑量組的保護(hù)作用與其它治療組無(wú)異，提示采用黃芪超微粉很低的劑量就可以有明顯的保肝CCl4所致的肝損傷作用。

A.黃芪超微粉對(duì)小鼠體重的影響；B.黃芪超微粉對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響；C.HE染色顯示黃芪超微粉對(duì)小鼠肝臟損傷的影響(×200倍)；D.黃芪超微粉對(duì)小鼠肝臟功能的影響。與對(duì)照組相比，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

3.3對(duì)負(fù)重游泳小鼠耐疲勞的影響 小鼠游泳實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組相比，黃芪各超微粉組以及黃芪飲片組游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，以黃芪超微粉高劑量組最為顯著，各治療組之間沒(méi)有顯著性差異(圖3A)。小鼠血中乳酸含量結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組小鼠乳酸含量明顯增加；與模型組相比，黃芪超微粉各劑量組以及黃芪飲片組乳酸含量明顯降低。各黃芪超微粉組游泳時(shí)間和乳酸含量沒(méi)有顯著差異(P<0.05)(圖3B)。這些結(jié)果提示黃芪超微粉具有對(duì)抗小鼠疲勞的作用。

A.黃芪超微粉對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響；B.黃芪超微粉對(duì)小鼠血中乳酸含量的影響。與對(duì)照組相比，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

3.4黃芪超微粉中黃芪甲苷含量測(cè)定 黃芪甲苷對(duì)照品的高效液相保留時(shí)間為14.388 min。黃芪甲苷回歸方程：Y=3377.4X+24.215(r=0.9998)，表明黃芪甲苷在0.02～0.375 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.02 μg·mL-1，HPLC信噪比≥3，黃芪甲苷回收率良好，儀器精密度及重現(xiàn)性符合HPLC含量測(cè)定要求。黃芪超微粉和黃芪飲片樣品的黃芪甲苷的峰分離較好(圖4)。黃芪超微粉和黃芪飲片樣品的黃芪甲苷含量分別為0.792±0.053%和0.495±0.041%，黃芪超微粉中黃芪甲苷的含量是黃芪飲片中黃芪甲苷含量的1.6倍，提示黃芪超微粉更易于溶出黃芪甲苷。

A.黃芪甲苷對(duì)照品；B.黃芪飲片；C.黃芪超微粉

表1 黃芪飲片和黃芪超微粉中黃芪甲苷含量比較

4 討論

中藥超微粉，粒徑一般在1～75 μm之間，在保持傳統(tǒng)中藥藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的同時(shí)，其最大的優(yōu)勢(shì)就是大大提高了藥物的吸收和生物利用度，減少了藥物用量，縮短了藥物起效時(shí)間[14]，給傳統(tǒng)中藥帶來(lái)了巨大的改變，在改善劑型、完善中藥炮制、開(kāi)發(fā)中藥新劑型等方面具有廣闊的發(fā)展空間[15-18]。中藥超微粉碎加工技術(shù)除了應(yīng)用于藥材、飲片加工外，還可對(duì)中藥提取物微粉化，尤其對(duì)難溶性提取物微粉化有著更重要的意義。中藥超微粉碎技術(shù)將對(duì)中藥行業(yè)產(chǎn)生新一輪技術(shù)革命，超微粉碎技術(shù)是促進(jìn)中藥傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)改造的有效途徑[19]。

黃芪為中醫(yī)常用中藥之一，臨床應(yīng)用量巨大。對(duì)各種肝損傷具有保護(hù)作用，具有提高機(jī)體抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體耐力的作用[20-22]。本研究利用低溫粉碎技術(shù)將黃芪飲片制成黃芪超微粉，比較黃芪飲片和黃芪超微粉對(duì)CCl4所致的肝損傷、耐游泳疲勞以及主要成分黃芪甲苷的影響，試圖闡釋黃芪超微粉的藥效和主要成分的變化。

顯微表征和粒度表征分析表明黃芪超微粉粒徑分布范圍為0.45～709 μm，小于80 μm的顆粒累積大于80%，提示我們制備的黃芪微粉大部分屬于超微粉的粒徑范圍。CCl4導(dǎo)致肝損傷是經(jīng)典模型之一，能準(zhǔn)確反應(yīng)肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化[23]。本研究采用1% CCl4橄欖油腹腔注射小鼠18 h后成功復(fù)制了肝損傷模型。病理結(jié)果顯示肝損傷模型小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重壞死現(xiàn)象，肝臟功能指標(biāo)AST和ALT均顯著增高，與其他學(xué)者制備的肝損傷模型指標(biāo)變化趨勢(shì)一致[23-24]。而10 g·kg-1黃芪飲片和10 g·g-1，2 g·kg-1個(gè)0.4 g·kg-1黃芪超微粉組均可以顯著逆轉(zhuǎn)1%CCl4所致的肝臟壞死和肝功能指標(biāo)的升高。我們采用游泳實(shí)驗(yàn)制備了疲勞模型，游泳實(shí)驗(yàn)可以很好的模擬機(jī)體的慢性疲勞狀態(tài)[25]。本研究顯示模型組小鼠的血中乳酸含量明顯提高，與其它研究者報(bào)道一致[26-27]，提示模型建立成功。本研究顯示10 g·kg-1黃芪飲片和10 g·kg-1，2 g·kg-1個(gè)0.4 g·kg-1黃芪超微粉組可以延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，可以明顯降低小鼠血中的乳酸含量，與朱凱峰[28]研究結(jié)果基本一致。黃芪甲苷是黃芪的主要指標(biāo)成分之一[9]，多個(gè)學(xué)者研究顯示黃芪超微粉碎后可以明顯提高包括黃芪甲苷多個(gè)成分在內(nèi)的溶出量[29-31]。本研究采用高效液相法檢測(cè)成分分析顯示，黃芪超微粉中黃芪甲苷含量明顯高于黃芪飲片，提示黃芪飲片破壁后有利于成分的溶出析出，這也可能是低劑量黃芪超微粉即顯示藥效的原因之一。本研究中值得關(guān)注的是0.4 g·kg-1黃芪超微粉組的肝保護(hù)作用和耐疲勞作用與黃芪飲片組相當(dāng)，但黃芪超微粉各劑量組之間沒(méi)有顯著差異，提示小劑量的黃芪超微粉即可與低于25倍的黃芪飲片作用相當(dāng)，但中高劑量的黃芪超微粉并沒(méi)有提高藥效，是否與體內(nèi)吸收的量有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。