李楚忠 鄭麗瓊 龔盛昭

廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司,廣東廣州，510663

我國女性歷來崇尚“膚如雪、凝如脂”，民間更有“一白遮百丑”的說法，東方女性素來有非常重的美白情節(jié)，誰都想擁有水嫩、白皙和通透的迷人肌膚。保濕是一切護膚步驟的基礎(chǔ)，美白保濕類化妝品占據(jù)了整個化妝品市場份額的一半以上，具有皮膚美白、保濕等功能的化妝品是時下亞洲最暢銷的化妝品之一。

近年來，市場上出現(xiàn)了越來越多的皮膚美白劑，如曲酸、熊果苷和壬二酸等，它們作為酪氨酸酶抑制劑而廣泛用于美白化妝品中。但這些美白劑大都是作用于單一路徑，美白效果往往不明顯，另外，這些美白劑還具有一定的安全隱患，如熊果苷及曲酸可能會導(dǎo)致接觸性皮炎，壬二酸會刺激皮膚而產(chǎn)生短暫性紅斑。所以，開發(fā)具有良好安全性、穩(wěn)定性，多通路美白機制的美白活性成分，已成為當前化妝品行業(yè)的主要研究方向之一，具有非常好的發(fā)展前景。

本文研制了一種高效的美白祛斑組合物，通過幾種不同作用機制的美白活性成分進行復(fù)配，研制出效果較好的美白祛斑組合物，并通過體外細胞實驗及人體實驗評估其美白、祛斑功效。

1 實驗部分

1.1 主要原料與儀器

1.1.1 主要原料

B16小鼠黑色素瘤細胞株、人角質(zhì)細胞HaCaT細胞，購自中科院上海細胞庫；DPPH、鄰苯三酚、酪氨酸酶，L-酪氨酸，DMSO，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（FBS購自Gibco，Lot：2276321）；美白祛斑組合物，由廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司研制，該組合物的詳細組分見表1。

表1 美白組合物各成分組成及含量

1.1.2 主要儀器

分析天平，A N D F X 3 0 0 0 i；恒溫水浴鍋HWS-24，上海一恒科學儀器有限公司；自動酶標儀（美國BioTEK公司）；生化孵育箱、離心機（美國Thermo公司）；生物安全柜（美國Thermo Scientific公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國MEMMERT公司）；皮膚生理無創(chuàng)檢測設(shè)備均為來自德國CK公司，日本美能達公司分光光度儀（Spectrophotometer CM-2500d）等。

2 實驗方法

2.1 人角質(zhì)細胞 HaCaT細胞活力測試

將HaCaT細胞進行傳代培養(yǎng)，制備濃度為（0.8～1.0）×105個/ml的細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)18～24 h；然后棄去孔中原培養(yǎng)液，每孔依次加入100 μl維持培養(yǎng)基（陰性對照），以及含有0.5%、1%、5%、10%、15%、20%美白組合物的維持培養(yǎng)基，返回培養(yǎng)箱孵育（48±1）h；取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育3～4 h，去除孔中液體，每孔加入100 μl DMSO，置于振蕩器振蕩10～15 min后，在酶標儀570 nm波長處測定吸光度。選擇細胞活力大于80%作為受試物的安全濃度。細胞存活率計算公式見式1。

2.2 體外細胞美白實驗測試

2.2.1 細胞內(nèi)酪氨酸酶活性測試

細胞培養(yǎng)方法同2.1。樣品作用濃度分別為2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；藥物作用3 d后，舍棄上清液，用pH 7.0的PBS溶液沖洗兩遍，每孔加90 μl含1% Triton X-100的PBS。冰水浴中超聲破碎震蕩5 min溶解細胞，經(jīng)37 ℃預(yù)溫后，每孔加入1% L-DOPA 10 μl，37 ℃下培育60 min，在酶標儀490 nm處測定各孔樣品的吸光度。酪氨酸酶合成抑制率計算公式見式2。

2.2.2 細胞內(nèi)黑色素含量測定

將B16黑色素細胞以10×104個/ml的密度接種于6板孔。每孔3 ml，培育24 h后，舍棄上清液，添加待測樣品，濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；樣品作用3 d后，舍棄上清液，用PBS溶液洗滌，每孔加入胰酶0.5 ml消化細胞，加入2 ml培養(yǎng)液終止消化，分別計數(shù)每組細胞。將細胞懸液離心舍棄上清液，得到沉淀物，再加入含有10%的DMSO的1 mol/L NAOH溶液，震蕩5 min。在酶標儀490 nm處測定各孔樣品的吸光度。黑色素的合成抑制率計算公式見式3。

2.2.3 自由基清除實驗

（1）超氧陰離子自由基清除作用的測定：取0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl 緩沖液4.5 ml，于25 ℃水浴鍋中預(yù)熱20 min。再加入1 ml試樣和0.4 ml 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后，于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mol/L的HCl 1.0 ml終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖液作為參比，在299 nm處測吸光度值。空白對照用1 ml試樣的溶劑來替代樣品。待測液對超氧陰離子自由基清除率的計算公式見式4。

式中A1為空白對照的吸光度值；A2為樣品的吸光度值。

（2）對羥自由基的清除能力測定：在25 ml比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 ml，1 mmol/L H2O23 ml，搖勻，接著加入6 mmol/L水楊酸3 ml，搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min后取出，測其吸光度；分別加入一定濃度的待測液，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測其吸光度。待測液對羧自由基（·OH）的清除率計算公式見式5。

式中A1為未加藥品前反應(yīng)體系的吸光度值；A2為樣品清除·OH后體系的吸光度值；A3為空白對照清除·OH后體系的吸光度值。

2.3 人體美白測試實驗

（1）測試方法及志愿者招募：根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版化妝品祛斑美白功效測試方法的具體要求進行檢驗。招募受試者共33人，其中男性6人，女性27人，年齡22～59歲，平均年齡（40.5±5.2）歲，符合受試者志愿入選標準和排除標準。

（2）紫外線黑化模型建立：首先測試入組的合格受試者背部的最小紅斑量（minimal erythema dose，MED），然后在受試部位選定3個面積不小于6 cm2的試驗區(qū)，分別為試驗產(chǎn)品區(qū)、陰性對照區(qū)和陽性對照區(qū)，每個試驗區(qū)之間的間隔不小于1.0 cm，并在每個試驗區(qū)內(nèi)選定面積不小于0.5 cm2的黑化測試區(qū)，用紫外線日光模擬儀按0.75倍MED劑量每天照射1次，連續(xù)照射4 d。

（3）膚色評測：照射結(jié)束后第5天，對各黑化測試區(qū)進行產(chǎn)品使用前的膚色視覺評估、皮膚色度儀、皮膚黑素檢測儀的測試。以皮膚色度儀測試的L＊a＊b＊顏色空間數(shù)值計算ITA°值，計算公式見式6。

在涂抹試驗物后每周對各黑化測試區(qū)皮膚顏色進行視覺評估和儀器檢測，并記錄。

（4）試驗物涂抹：根據(jù)隨機表在試驗區(qū)按照（2.00±0.05）mg/cm2的用量涂抹試驗物（陰性對照區(qū)不涂抹任何產(chǎn)品）。產(chǎn)品使用頻率為2次/d（2次涂抹間隔時間不小于4 h），連續(xù)涂抹試驗物4周。

試驗產(chǎn)品：含2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露。

陰性對照：黑化區(qū)空白對照。

陽性對照：7%維生素C制品，按規(guī)范方法附錄Ⅰ配方制備（4 ℃冷藏、鋁管避光保存）。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 人角質(zhì)細胞HaCaT細胞活力測試

測試美白祛斑組合物樣品濃度分別為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%對B16細胞增殖率的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度下樣品對HaCaT細胞活力的影響

由表2實驗結(jié)果可知，組合物作用濃度在20%及以內(nèi)，人角質(zhì)細胞HaCaT細胞活力均大于80%，表明在20%作用濃度內(nèi)均為安全作用濃度。

3.2 細胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制測試

通過體外酪氨酸酶實驗測試美白祛斑組合物對酪氨酸酶的抑制效果，選擇組合物測試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同質(zhì)量濃度下樣品對酪氨酸酶的抑制率

從實驗結(jié)果可以看出，本文制備的美白祛斑組合物在作用濃度為0.05%的濃度下，酪氨酸酶抑制率達到了60.47%，對酪氨酸酶的抑制效果隨著美白組合物濃度的增加而提高，表現(xiàn)出良好的酪氨酸酶抑制作用。

3.3 細胞內(nèi)黑色素合成的抑制率結(jié)果

通過體外測試美白祛斑組合物對B16黑色素細胞合成黑色素的抑制效果，選擇測試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實驗結(jié)果見表4。

表4 不同質(zhì)量濃度下樣品對黑色素生成的抑制率

從實驗結(jié)果可以看出，本文制備的美白祛斑組合物在作用濃度為0.05%的濃度下，對黑色素生成的抑制率達到了55.49%，黑色素生成的抑制效果隨著美白組合物濃度的增加而提高，表現(xiàn)出良好的抑制黑色素生成作用。

3.4 自由基清除實驗測試結(jié)果

通過體外測試美白祛斑組合物對超氧陰離子自由基及羥自由基的清除效果，選擇測試濃度分別為5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，實驗結(jié)果見表5。

表5 不同質(zhì)量濃度下樣品對自由基的清除效果

從實驗結(jié)果可以看出，本文制備的一種美白祛斑組合物對超氧陰離子自由基和羥自由基具有一定的清除作用。在作用濃度達到2%時，清除兩種自由基效果分別達到了75.35%和72.05%，其清除自由基的效果隨著美白組合作用濃度的增加而增強。

3.5 人體美白測試結(jié)果分析

表7 受試物使用前后皮膚ITA°差值（均值±標準差）

在做完美白組合物的體外酪氨酸酶抑制實驗、黑色素抑制實驗以及自由基清除實驗后，選擇使用濃度為2%的美白祛斑組合物添加到精華露中，制備得到含有2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露，并通過人體實驗驗證樣品的美白效果。結(jié)果見表6～表8。

表6 受試物使用前后視覺膚色評估差值[中位數(shù)（最小值，最大值）]

表8 受試物使用前后皮膚MI差值（均值±標準差）

根據(jù)表6～表8的實驗結(jié)果可以得出，實驗產(chǎn)品（含2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露）紫外線誘導(dǎo)人體皮膚黑化模型祛斑美白功效測試的結(jié)果為：實驗產(chǎn)品涂抹3周、4周后，膚色視覺評分在涂抹前后差值與陰性對照相比有顯著改善（P＜0.05）；涂抹3周、4周后，ITA°在涂抹前后差值與陰性對照相比有顯著改善（P＜0.05）；涂抹1周、2周后，MI在涂抹前后差值與陰性對照相比有顯著改善（P＜0.05）；整體判斷實驗產(chǎn)品與陰性對照相比皮膚黑化顯著改善（P＜0.05），表明2%美白祛斑組合物的美白祛斑精華露具有祛斑美白功效。

4 結(jié)論

本文研制了一種具有高效美白效果的美白祛斑組合物并通過體外和人體實驗評價了組合物的美白祛斑效果。

（1）采用人角質(zhì)細胞HaCaT細胞活力測試驗證了組合物的安全性能，在作用濃度在20%及以內(nèi)，人角質(zhì)細胞HaCaT細胞活力均大于80%，表明在20%作用濃度內(nèi)均為安全使用濃度。

（2）采用體外酪氨酸酶及黑色素抑制實驗測試，結(jié)果得出，美白祛斑組合物對酪氨酸酶及黑色素合成抑制率最高可達到99.15%和91.37%。

（3）通過體外自由基清除實驗，驗證美白祛斑組合物具有一定的自由基清除功效，對超氧陰離子自由基、羥自由基的清除效果，最高可達到88.23%及86.65%

（4）采用2%美白祛斑組合物，制備得到美白祛斑精華露，并按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版化妝品祛斑美白功效測試方法，通過人體實驗測試結(jié)果可得出，2%美白祛斑組合物的美白精華露具有良好的美白祛斑效果，受試者在使用產(chǎn)品4周后，在膚色視覺評分、ITA°、黑色素MI值等多項指標上具有顯著性的改善（P＜0.05），樣品具有良好的美白祛斑功效。