柚皮苷聯(lián)合頭穴針刺對腦缺血大鼠血管新生及Notch1/Akt/eNOS通路的影響

陳 悅，王珍珍，王文生·王月，李 喆

(1. 烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200052)

缺血性腦卒中是一類具有高病死率、高致殘率的常見腦血管疾病，主要由頸椎動(dòng)脈狹窄閉塞，局部血流量減少所致，以腦組織缺血壞死所引起的神經(jīng)功能癥狀為主要表現(xiàn)[1]。腦組織缺氧缺血發(fā)生后，如能盡早恢復(fù)局部血供，重建微血管循環(huán)，則可明顯減輕缺血區(qū)組織梗死，加快神經(jīng)功能的修復(fù)[2]。有研究表明，腦組織缺血后，Notch1/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路可參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲，并通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體的表達(dá)介導(dǎo)微血管代償性再生，是調(diào)節(jié)腦缺血疾病微血管新生的重要靶點(diǎn)[3-4]。柚皮苷可改善腦缺血再灌注損傷，且在骨折愈合過程中可有效促進(jìn)血管生成，但其對腦缺血損傷的保護(hù)作用是否與促血管新生相關(guān)尚未明確[5-6]。頭穴針刺在腦血管疾病的康復(fù)治療中應(yīng)用廣泛，在腦缺血大鼠模型中，可誘導(dǎo)缺血區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和微血管新生[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過柚皮苷灌胃和針刺經(jīng)驗(yàn)效穴“百會”“風(fēng)府”療法干預(yù)局灶性腦缺血大鼠，評價(jià)二者單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)效果，并通過Notch1/Akt/eNOS 信號通路探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD雄性大鼠120只，體重180～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號： SCXK(新)2020-0024。實(shí)驗(yàn)開始前于溫度(23±3)℃、相對濕度40%～70%、明暗12 h交替的SPF級動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，定期更換墊料。本研究方法和目的符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理學(xué)要求，所有內(nèi)容均經(jīng)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批通過(2021L013)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 柚皮苷購自Sigma公司，用生理鹽水稀釋至所需濃度；尼莫地平購自山東新華制藥股份有限公司(20 mg/片)；華佗牌一次性無菌毫針購自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司(0.22 mm×25 mm)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2) ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；VEGF一抗、羊抗大鼠IgG-生物素、DAB試劑盒購自武漢博士德公司；Notch1、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)、eNOS、磷酸化eNOS(p-eNOS)、GAPDH鼠單克隆抗體購自Santa Crutz公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，基因上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將SD大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組、柚皮苷+頭穴針刺組，每組20只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均采用血管內(nèi)栓線阻斷法制備局灶性腦缺血模型[9]：大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，局部皮膚消毒，隨后于頸部正中切開1 cm，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用縫合線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，同時(shí)用微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在距離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉約5 mm處用顯微剪剪開一小口，將栓線由頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，再經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈以阻斷其血流，隨后結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，逐層縫合切口并碘伏消毒，假手術(shù)組僅分離上述血管而不插栓線。造模后參考Longa等[10]標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分，評分為1～4分即為模型制備，將造模成功大鼠納入實(shí)驗(yàn)，剔除未成功及意外死亡大鼠，并按實(shí)驗(yàn)條件隨機(jī)補(bǔ)充大鼠。造模成功后，尼莫地平組給予尼莫地平混懸液12 mg/kg灌胃；柚皮苷組給予柚皮苷溶液80 mg/kg灌胃；頭穴針刺組給予頭穴針刺干預(yù)，參照《大鼠穴位圖譜》定位百會、風(fēng)府穴后，使用毫針針刺，連接電針儀(連續(xù)波，頻率150 Hz)，每次留針15 min；柚皮苷+頭穴針刺組給予柚皮苷溶液80 mg/kg灌胃和頭穴針刺干預(yù)(操作同頭穴針刺組)；假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組均每天干預(yù)1次，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1神經(jīng)功能障礙評分 干預(yù)結(jié)束后，參考Longa等[10]標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠神經(jīng)功能障礙進(jìn)行評分并比較。評分標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)行為未見異常為0分；提起鼠尾，缺血側(cè)前肢不能完全伸展、內(nèi)旋為1分；行走時(shí)向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈，不能直行為2分；行走時(shí)向手術(shù)對側(cè)傾斜，行走有困難為3分；意識出現(xiàn)障礙，不能自發(fā)行走為4分。

1.4.2腦組織含水量 神經(jīng)功能障礙評分結(jié)束后腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，腹腔取血后，各組隨機(jī)選取5只大鼠斷頭處死，取腦組織。采用預(yù)冷生理鹽水清洗腦組織，定性濾紙吸干水分后精密稱重，即得腦組織濕重；隨后將腦組織置于60 ℃ 的恒溫箱中放置72 h，烘干后取出，反復(fù)稱重，至2次重量差<0.3 mg時(shí)即為腦組織干重。隨后根據(jù)公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.3腦梗死體積 腹腔取血后，各組隨機(jī)選取5只大鼠斷頭處死，取腦組織，采用TTC染色測定腦梗死體積：預(yù)冷生理鹽水沖洗腦組織，定性濾紙上吸干水分后置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍 20 min，將腦組織沿冠狀面每隔2 mm切片，切成均勻的5片，置于2% TTC染液于37 ℃ 溫箱中避光孵育30 min，經(jīng)PBS沖洗3次后，4%多聚甲醛中固定24 h后，將大腦切片取出觀察拍照，正常腦組織為紅色，梗死區(qū)域?yàn)榘咨蛭慈旧?，用Image Pro軟件分析并計(jì)算腦梗死體積：腦梗死體積=腦梗死面積/腦切片面積×100%。

1.4.4血清中VEGF、VEGFR-2水平 神經(jīng)功能障礙評分結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min下離心15 min，將所得血清分裝凍存?zhèn)溆?，根?jù)ELISA試劑盒操作步驟檢測血清中VEGF、VEGFR-2水平。

1.4.5海馬組織中VEGF陽性表達(dá)情況 腹腔取血后，各組隨機(jī)選取5只大鼠，開胸暴露心臟并剪開左心室，將灌注針從左心室插入至升主動(dòng)脈固定，隨后灌注4 %多聚甲醛PBS溶液150 mL，1 h后取腦組織，置于4 %多聚甲醛溶液中，4 ℃下固定72 h，將腦組織沿冠狀面切成2 mm厚的腦片，取含海馬的腦片進(jìn)行石蠟包埋，切片，將切片脫蠟、透明、脫水后，0.3%的H2O2室溫下封閉20 min，蒸餾水洗后行抗原熱修復(fù)，5%BSA封閉20 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，SABC 37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蒸餾水沖洗后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察VEGF陽性表達(dá)情況并拍照(陽性呈棕黃色至棕褐色，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì))，采用Image J軟件計(jì)算3個(gè)視野的VEGF陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4.6海馬組織中Notch1/Akt/eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 腹腔取血后，各組隨機(jī)選取5只大鼠處死，取海馬組織，置于RIPA裂解液中提取組織總蛋白，采用BCA試劑盒于562 nm波長測定總蛋白濃度，制膠后上樣10 μL蛋白樣品，經(jīng)凝膠電泳分離，PVDF轉(zhuǎn)膜后，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加一抗溶液4 ℃過夜，TBST洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像儀曝光拍攝，采用Image J軟件測定各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Notch1蛋白相對表達(dá)量及p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS。

1.4.7海馬組織中Notch1/Akt/eNOS通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 取大鼠海馬組織，采用Trizol一步法提取海馬組織總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA 濃度，取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒操作步驟檢測Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA表達(dá)情況。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 s，退火溫度 60 ℃ 34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，用2ΔΔCt法計(jì)算Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA相對表達(dá)量。各基因引物序列：Notch1上游5’- CAGCCACCATCACAGCCACA-3’，下游5’-ATGCCCTCGGACCAATCAGA -3’；p-Akt上游5’-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3’，下游5’- GGGTCTTCGGGCTTCAGGTTA-3’；p-eNOS上游5’-GCATACCCGCACTTCTGT-3’，下游5’- GCCTTGGCATCTTCTCCC -3’；GAPDH上游5’-TACCCACGGCAAGTTCAACG -3’，下游5’-CACCAGCATCACCCCATTTG-3’。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺陷，模型組、尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組和柚皮苷+頭穴針刺組大鼠神經(jīng)功能評分分別為(2.27±0.79)分、(1.44±0.45)分、(1.60±0.56)分、(1.67±0.51)分、(1.49±0.43)分，尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組和柚皮苷+頭穴針刺組評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯低于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠腦組織含水量及腦梗死體積比較 模型組大鼠腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，存在明顯腦梗死；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組和柚皮苷+頭穴針刺組大鼠腦組織含水量和腦梗死體積均明顯低于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯低于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平比較模型組大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組及柚皮苷+頭穴針刺組大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯高于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和腦缺血各組大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平比較

2.4各組大鼠海馬組織中VEGF陽性表達(dá)情況比較 假手術(shù)組海馬組織CA1區(qū)可見少量VEGF陽性細(xì)胞；模型組VEGF陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組及柚皮苷+頭穴針刺組VEGF陽性染色細(xì)胞數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯多于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖 2。

圖1 假手術(shù)組和腦缺血各組大鼠海馬組織中VEGF陽性表達(dá)情況(IHC，×200)

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為尼莫地平組；D為柚皮苷組；E為頭穴針刺組；F為柚皮苷+頭穴針刺組

2.5各組大鼠海馬組織中Notch1/Akt/eNOS通路蛋白表達(dá)情況比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中Notch1蛋白相對表達(dá)量明顯增高，p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值明顯降低(P均<0.05)；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組及柚皮苷+頭穴針刺組大鼠海馬組織中Notch1蛋白相對表達(dá)量及p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值均明顯高于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯高于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為尼莫地平組；D為柚皮苷組；E為頭穴針刺組；F為柚皮苷+頭穴針刺組

2.6各組大鼠海馬組織中Notch1/Akt/eNOS通路mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中Notch1 mRNA相對表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，p-Akt和p-eNOS mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組及柚皮苷+頭穴針刺組大鼠海馬組織中Notch1、p-Akt 、p-eNOS mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯高于柚皮苷組、頭穴針刺組(P均<0.05)，柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和腦缺血各組大鼠海馬組織中Notch1/Akt/eNOS通路相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

缺血區(qū)新生微血管的形成能夠增加局部微循環(huán)血量，改善血液循環(huán)，是缺血性腦損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵[11]。在缺血性腦卒中發(fā)病初期，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生可逆性變性，如能有效促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，及時(shí)恢復(fù)局部血流量，可為受損神經(jīng)細(xì)胞功能的修復(fù)提供良好的微環(huán)境，進(jìn)而減輕缺血區(qū)腦組織損傷程度，促進(jìn)患者神經(jīng)功能的恢復(fù)[12]。

柚皮苷是從蕓香科植物柚的果皮和果實(shí)中所提取的一種黃酮類化合物，能夠在心血管疾病中發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用[13]。在腦缺血再灌注損傷大鼠模型中，柚皮苷具有抗氧化、加速自由基清除作用，可顯著減輕大鼠腦組織水腫，縮小梗死體積[5]。Song等[6]研究顯示，在去勢大鼠骨折愈合過程中，柚皮苷可通過調(diào)節(jié)VEGF和VEGFR-2的表達(dá)刺激血管生成，促進(jìn)大鼠骨痂處血管生長。而柚皮苷是否可通過促進(jìn)微血管生成發(fā)揮腦保護(hù)作用尚不明確。

頭針作為一種行之有效的中醫(yī)治療手段，在腦血管疾病的康復(fù)治療中得到了廣泛應(yīng)用，并證實(shí)可加快腦卒中患者腦功能的康復(fù)[14]。李虹霖等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對頭部穴位的刺激可通過生物電效應(yīng)刺激大腦皮質(zhì)，使變性受損的神經(jīng)細(xì)胞覺醒，以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的修復(fù)。樊云等[16]研究發(fā)現(xiàn)，頭穴針刺還可促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，刺激腦內(nèi)微血管新生。百會、風(fēng)府均為督脈之要穴，是治療腦缺血性疾病常用穴位，正如《行針指要歌》原文中所記載“或針風(fēng)，先向風(fēng)府百會中”。督脈為人體諸陽之總匯，百會為督脈、手足三陽經(jīng)及足厥陰經(jīng)之會，居于頭頂中央最高位，統(tǒng)領(lǐng)一身之陽；風(fēng)府為督脈與陽維脈之會；聯(lián)合針刺二穴，可起到開竅醒神、疏經(jīng)通絡(luò)、振奮陽氣之功。

本實(shí)驗(yàn)通過線栓法復(fù)制局灶性腦缺血模型，評價(jià)柚皮苷、頭穴針刺單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對大鼠受損腦組織和神經(jīng)功能的修復(fù)效果，結(jié)果顯示柚皮苷和頭穴針刺單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均能有效降低大鼠神經(jīng)功能評分，減輕腦組織水腫，縮小梗死體積，其中柚皮苷與頭穴針刺聯(lián)合應(yīng)用效果更為顯著。

目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞特異性的VEGF與其功能受體VEGFR-2結(jié)合后，可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促使毛細(xì)血管瓣生成，對腦組織缺氧缺血后血管新生起到正性調(diào)控作用[17]。在腦缺血血管新生過程中，VEGF和Notch相互調(diào)控，VEGF在缺氧缺血環(huán)境下能夠誘導(dǎo)Notch受體Notch 1活化，而阻斷VEGF后，可見Notch的表達(dá)明顯減少[18]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其活化與內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化關(guān)系密切[19]。多項(xiàng)研究表明，Akt 和Notch1信號之間存在相互作用，Notch1/Akt通路可參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和侵襲[20-21]。激活的Akt 可進(jìn)一步促使其下游效應(yīng)分子eNOS磷酸化，后者可通過上調(diào)VEGF等血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)發(fā)揮促血管新生作用[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清VEGF和VEGFR-2水平及海馬組織中VEGF陽性表達(dá)數(shù)、Notch1蛋白及mRNA相對表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組，p-Akt/ Akt和p-eNOS/ eNOS比值均明顯低于假手術(shù)組；尼莫地平組、柚皮苷組、頭穴針刺組和柚皮苷+頭穴針刺組大鼠血清VEGF和VEGFR-2水平，海馬組織中VEGF陽性表達(dá)數(shù)、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值、Notch1蛋白及Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA相對表達(dá)量均明顯高于模型組，且柚皮苷+頭穴針刺組和尼莫地平組均明顯高于柚皮苷組、頭穴針刺組。表明柚皮苷和頭穴針刺能夠通過促進(jìn)Notch1/Akt/eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活發(fā)揮促血管新生作用。

綜上所述，柚皮苷和頭穴針刺治療可通過促進(jìn)腦缺血大鼠Notch1/Akt/eNOS信號通路的活化，促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，從而改善缺血區(qū)組織周圍血流灌注，進(jìn)而減輕大鼠腦組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，且二者在發(fā)揮各自作用的同時(shí)相輔相成，協(xié)同增效。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。