芪黃湯對免疫性血小板減少癥小鼠作用機(jī)制研究

周 林， 禹 紅， 萬 敏， 劉毓玲， 段 波， 王進(jìn)軍

武漢市中醫(yī)醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.風(fēng)濕血液病科，湖北 武漢 430050

免疫性血小板減少癥(immune thrombopenia，ITP)是以皮膚黏膜出血、外周血小板水平降低等為臨床表現(xiàn)的一種自身免疫性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制主要與血小板自身抗原免疫耐受性缺失有關(guān)。自身抗原免疫耐受缺失使體液免疫和細(xì)胞免疫被異常激活，導(dǎo)致血小板生成不足及破壞加速[2]。ITP治療的目的在于使血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)維持在安全水平內(nèi)，控制出血，阻止血小板過度破壞并促進(jìn)血小板生成[3]。芪黃湯是武漢市中醫(yī)醫(yī)院萬遠(yuǎn)鐵教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，此方經(jīng)多年實(shí)踐證明具有顯著治療ITP的臨床療效。本研究旨在探討芪黃湯對ITP模型小鼠的作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Balb/C小鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，7～8周齡，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供，使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104。豚鼠25只，雌性，體質(zhì)量240～260 g，12周齡，由興平市天瑞實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供，使用許可證號：SYXK(鄂)2017-0065。

1.2 試劑與儀器 芪黃湯：生地黃15 g，熟地黃15 g，枸杞子15 g，山萸肉12 g，菟絲子15 g，女貞子15 g，旱蓮草15 g，黃芪15 g，太子參15 g，茯苓15 g，蔻仁12 g，山藥18 g(由武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部提供)，水煮濃縮至2 g/ml。醋酸潑尼松片由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H20033023，生產(chǎn)批號：190713。用生理鹽水將潑尼松粉末配置成混懸液(濃度為0.72 g/L)，置于4℃冰箱冷藏備用。磷酸鹽緩沖液(貨號P4417)、不完全弗氏佐劑(FICA，貨號F5506)、完全弗氏佐劑(FCA，貨號F5881)購自Sigma公司；FITC anti-mouse CD4(貨號102348)、FITC anti-mouse CD8a(貨號101428)、PE anti-mouse CD279(PD-1，貨號135206)、PE anti-mouse CD274(PD-L1，貨號102298)購自Biolegend公司。HEMAVET 950FS動物血液分析儀(美國Drew)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD)。

1.3 研究方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清制備 取10只Balb/C小鼠，麻醉后提取抗凝全血，階梯式離心獲取血小板(分別以1 000 r/min、3 000 r/min離心10 min，半徑為6 cm)，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度為2.5×106個/ml，分別與等量的FCA和FICA混合作為抗原，于造模第0周注射含F(xiàn)CA抗原1 ml，注射于豚鼠的足掌、背部、腹部皮下等至少6點(diǎn)，每點(diǎn)100 μl；于第1、2、4周注射含F(xiàn)ICA抗原，方法同上。第5周取豚鼠心臟未抗凝全血，離心后分離血清，得到豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。使用前制備Balb/C小鼠5%紅細(xì)胞懸液吸附2次，檢驗(yàn)抗體效價，稀釋成最佳濃度待用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 取剩余Balb/C小鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常組、模型組、潑尼松組、芪黃湯組，每組各20只。模型組、潑尼松組、芪黃湯組均用GP-APS建立ITP模型。具體方法：正常組以100 μl/20 g生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，模型組、潑尼松組、芪黃湯組以100 μl/20 g的GP-APS進(jìn)行腹腔注射，隔日1次，共8次。PLT在原始水平的11%～25%提示ITP動物模型造模成功[4]。造模成功第5天開始灌胃給藥，正常組、模型組用生理鹽水0.2 ml灌胃；潑尼松組用生理鹽水制成的潑尼松混懸液0.2 ml灌胃；芪黃湯組用芪黃湯0.2 ml灌胃。每組均1次/d，連續(xù)灌胃10 d。

1.4 觀察指標(biāo) 眼球摘除法取血，EDTA-Na2抗凝管、動物血液分析儀檢測小鼠PLT，流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+表達(dá)。處死小鼠，快速剝離股骨，用6號針頭以1 ml生理鹽水沖出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管內(nèi)，制成骨髓細(xì)胞懸液，采用動物血液分析儀檢測骨髓有核細(xì)胞數(shù)量[5]。剖腹取脾，稱重。

脾指數(shù)=脾重/體質(zhì)量

2 結(jié)果

2.1 各組PLT、骨髓有核細(xì)胞、脾指數(shù)比較 與正常組比較，模型組、芪黃湯組、潑尼松組的PLT、骨髓有核細(xì)胞降低，脾指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，芪黃湯組、潑尼松組的PLT、骨髓有核細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組PLT、骨髓有核細(xì)胞、脾指數(shù)比較

2.2 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達(dá)升高，CD4+表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，波尼松組、芪黃湯組小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達(dá)降低，CD4+表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)比較

3 討論

ITP是一種自身免疫性血液病，可能的發(fā)病機(jī)制包括機(jī)體免疫耐受失衡，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的血小板破壞，骨髓巨核細(xì)胞發(fā)育成熟障礙，以及血小板生成減少[5-6]。免疫反應(yīng)包括抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞間的相互作用，自身反應(yīng)性T細(xì)胞對血小板自身抗原缺失耐受，通過T細(xì)胞受體識別血小板抗原?；罨腡細(xì)胞不僅激活B細(xì)胞導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生，還促進(jìn)細(xì)胞因子的生成和CTL的活化。PD-1(CD279)是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于免疫球蛋白CD28家族，在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，對維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用；PD-1的配體PD-L1(CD274)是Ⅰ型跨膜蛋白受體B7家族的成員，廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的肥大細(xì)胞和一些非造血細(xì)胞[7-8]。PD-1/PD-L1在T細(xì)胞成熟、分化和增殖過程中能夠提供負(fù)性共刺激信號，在機(jī)體免疫功能異?？哼M(jìn)時代償性分泌增多，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。

中醫(yī)認(rèn)為，ITP歸屬于“血證”“紫斑”等范疇，將其命名為“紫癜病”，多由外感及內(nèi)傷所致，外感風(fēng)熱毒邪等因素，因?qū)嵵绿?，?nèi)傷則為脾不統(tǒng)血，氣不攝血，致臟腑氣血虧虛，兩者共同導(dǎo)致血不循經(jīng)，血溢脈外，出現(xiàn)紫斑，因此應(yīng)以益氣養(yǎng)血、健脾補(bǔ)腎為治療原則。芪黃湯中，生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津；熟地黃養(yǎng)血滋陰，益精填髓；枸杞平補(bǔ)肝腎、滋補(bǔ)強(qiáng)壯；山萸肉滋肝補(bǔ)腎、益氣血；菟絲子為補(bǔ)腎、肝、脾之良藥；女貞子養(yǎng)陰益腎，補(bǔ)氣舒肝；旱蓮草補(bǔ)益肝腎，涼血止血；黃芪補(bǔ)氣健脾，太子參補(bǔ)益脾肺，益氣生津，配伍黃芪，補(bǔ)益之效大增；茯苓、蔻仁、山藥可健脾和胃，全方共奏益氣養(yǎng)血，健脾補(bǔ)腎之效[11]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，地黃含有糖類、氨基酸、苯乙醇苷類等多種成分，具有抗衰老、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用。地黃多糖能夠誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，還能夠抑制免疫抑制模型小鼠單核細(xì)胞吞噬功能，提高PLT[12]。黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗應(yīng)激、降壓等作用，其主要成分黃芪多糖可提高T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)機(jī)體對干擾素的誘生，具有雙向調(diào)節(jié)免疫功能的作用[13]。黃芪和生地黃配伍，清熱涼血、益氣扶正，可抑制體液免疫亢進(jìn)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群失衡，糾正免疫紊亂[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠外周血CD8+表達(dá)升高，CD4+表達(dá)降低，提示ITP小鼠外周血CD8+T細(xì)胞活性更高。CD4+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)方式主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對抗原的反應(yīng)及分泌相關(guān)細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)；而ITP患者中的CD8+T細(xì)胞在體外可以直接破壞血小板，經(jīng)治療后緩解的ITP患者CD8+T細(xì)胞在體外破壞血小板的能力則明顯下降[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，某些自身免疫疾病的外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1升高，且與疾病的活動度可能相關(guān)[16]。此外，新發(fā)ITP患者CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1升高，且PD-1/PD-L1升高與ITP患者疾病活動程度有一定關(guān)系[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+均較正常組升高，而CD8+PD-1+、CD8+PD-L1+與正常組無差異，提示異常的CD4+T細(xì)胞PD-1/PD-L1負(fù)性刺激通路可能參與ITP的發(fā)病過程，是自身免疫系統(tǒng)的一種保護(hù)機(jī)制，發(fā)揮免疫抑制反應(yīng)作用。

自身反應(yīng)性T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體識別血小板抗原并被激活，不僅可以上調(diào)活化T細(xì)胞的PD-1+表達(dá)，還可以促進(jìn)Th1炎性細(xì)胞因子的分泌，從而進(jìn)一步提高活化T細(xì)胞上PD-1+的表達(dá)[18]。本研究中，正常組T細(xì)胞因不能識別血小板抗原而被激活，CD4+T細(xì)胞上的PD-1+、 PD-L1+表達(dá)較模型組明顯呈現(xiàn)低水平狀態(tài)，保持機(jī)體正常的免疫功能；芪黃湯組和潑尼松組PLT、骨髓有核細(xì)胞高于模型組，而脾指數(shù)無明顯差異，提示芪黃湯和潑尼松具有同樣良好的治療效果，但均不能控制脾增大；芪黃湯組小鼠外周血CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達(dá)低于模型組，提示芪黃湯可能通過調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞降低機(jī)體細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)，CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達(dá)降低提示負(fù)性調(diào)節(jié)的自身保護(hù)機(jī)制也趨于平衡，最終達(dá)到免疫平衡，進(jìn)而改善病情。

綜上所述，芪黃湯可顯著提高ITP模型小鼠PLT、骨髓有核細(xì)胞數(shù)，其機(jī)制可能與降低CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，抑制T細(xì)胞活化和增殖，調(diào)節(jié)CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達(dá)平衡有關(guān)。