青花椒精油抑制蠟樣芽孢桿菌的活性與機理

趙 馳，董 玲，張鳳菊，陳善波，胡 文，趙躍軍，黃志標，朱永清，李治華,*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院食物與營養(yǎng)健康研究所，四川 成都 610066；3.四川省林業(yè)科學研究院，四川 成都 610081；4.漢源縣花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，四川 雅安 625399；5.幺麻子食品股份有限公司，四川 眉山 620360；6.四川廣安和誠林業(yè)開發(fā)有限責任公司，四川 廣安 638019）

蠟樣芽孢桿菌（）是一種普遍存在于食物、土壤和人體皮膚等環(huán)境中的革蘭氏陽性食源性病原菌，其能夠產(chǎn)生溶血素BL（hemolysin BL，HBL）、非溶血性腸毒素（nonhemolytic enterotoxin，Nhe）、細胞毒素K（cytotoxin K，CytK）和致吐毒素等引起腹瀉和嘔吐的細胞毒素和酶。據(jù)統(tǒng)計，全世界1.4%～12%的食物中毒事件由該菌引起，蠟樣芽孢桿菌已經(jīng)對食品安全和人類健康造成了嚴重的威脅。目前應對食源性病原菌對食品污染最為常用的一種手段是添加化學防腐劑，但是其造成的安全性問題正日益突出。而植物精油是由植物根、莖、果實等部位提取的生物活性物質(zhì)，其抑菌能力已經(jīng)得到證實，同時其還具有安全和不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點，使其具有開發(fā)為天然防腐劑的潛力。

青花椒屬蕓香科（Rutaceae）花椒屬（）植物，其廣泛種植于中國西南部地區(qū)，具有悠久的歷史，是一種重要的經(jīng)濟作物。其果皮因具有獨特的香氣和麻味而作為一種調(diào)味料廣泛應用于中餐的烹飪中。同時，青花椒已經(jīng)被正式列入《中國藥典》，被用作多種中醫(yī)處方藥的有效成分，用于治療腹痛、嘔吐、牙疼等多種疾病。此外，花椒的抑菌能力也得到了廣泛的關(guān)注，其中花椒揮發(fā)油的抑菌能力已經(jīng)得到證實，其能夠抑制大腸桿菌（）、金黃色葡萄球菌（）和枯草芽孢桿菌（）等多種食源性病菌。但是現(xiàn)有研究主要關(guān)注其抑菌活性，對其抑菌機理還鮮有報道。

本研究首先對青花椒精油的化學組成進行分析，隨后以蠟樣芽孢桿菌為研究對象，通過理化、形態(tài)學和代謝組學的方法對其抑菌機理進行探討，以期為青花椒資源的充分利用和進一步開發(fā)以青花椒為原料的新型抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌菌株購自廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center，GDMCC），菌株編號GDMCC 1.602。

青花椒購自四川省川珍實業(yè)有限公司。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活力試劑盒南京建成生物工程研究所；鈣磷脂結(jié)合蛋白V-熒光素APC/碘化丙啶（annexin V-fluorescein APC/propidium iodide，Annexin V-APC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒上海元牧生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司；吡啶（分析純）、甲氧銨鹽（分析純）、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%（質(zhì)量分數(shù)）三甲基氯硅烷）美國Sigma公司；瓊脂粉、戊二醛、乙醇、異丙醇、乙睛（均為分析純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Intuvo 9000-MSD 5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 美國安捷倫公司；New Brunswick Innova 43恒溫搖床、Centrifuge 5418 R離心機 德國Eppendorf公司；JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；Inspect掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；EM TP組織處理機、EM KMR3玻璃制刀機 德國徠卡公司；SynergyHTX多功能酶標儀 美國BioTek公司；Cytoflex流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司；FDU-2110冷凍干燥機 日本東京理化器械株式會社。

1.3 方法

1.3.1 青花椒精油制備及其化學組成分析

參考文獻[15]的方法稍作修改進行青花椒精油提取。將青花椒粉碎過40 目篩。稱取40 g青花椒粉和400 mL水，置于1 L的圓底燒瓶中加熱煮沸，循環(huán)提取4 h后過濾提取液，然后用無水硫酸鈉脫水得到青花椒精油（回收率為5.35%），-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻[16]采用GC-MS分析青花椒精油的化學組成。色譜柱：HP-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，以10 ℃/min升至180 ℃，最后以8 ℃/min升至220 ℃，并保持15 min。載氣（He）流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；進樣量1 μL；分流比1∶20。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離，電子能量為70 eV；掃描范圍/35～600；傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃和230 ℃。

數(shù)據(jù)處理：使用LECO Chroma TOF軟件將原始數(shù)據(jù)與NIST 17L數(shù)據(jù)庫進行匹配（匹配度＞70%），同時采用LECO Chroma TOF軟件計算化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），并與NIST Chemistry WebBook數(shù)據(jù)庫（https://webbook.nist.gov/chemistry/）比對，進行化合物鑒定。使用面積歸一法進行化合物的相對定量。

1.3.2 青花椒精油的抑菌活性

參考文獻[14]測定青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌質(zhì)量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。取0.1 g凍存的蠟樣芽孢桿菌加入新鮮NB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h進行活化，然后以接種量0.1%添加至新鮮NB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實驗。用新鮮NB培養(yǎng)基調(diào)整蠟樣芽孢桿菌濃度至1×10CFU/mL，加入青花椒精油（終質(zhì)量濃度分別為16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL）。將蠟樣芽孢桿菌置于恒溫搖床（37 ℃、180 r/min）培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液保持澄清的青花椒精油最小質(zhì)量濃度為MIC。用滅菌后的接種環(huán)蘸取培養(yǎng)液，然后在NB固體培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基含1.5%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂）上劃線，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，以沒有菌落出現(xiàn)的最低青花椒精油質(zhì)量濃度為MBC。

1.3.3 AKP活力測定

將含有MIC和MBC青花椒精油的蠟樣芽孢桿菌懸液（1×10CFU/mL）置于搖床（180 r/min、37 ℃）中孵育3 h。以不含青花椒精油的菌懸液作為空白對照。孵育結(jié)束后12 000 r/min、4 ℃離心5 min收集上清液。然后根據(jù)AKP檢測試劑盒說明書測定AKP活力。

1.3.4 Annexin V-APC/PI染色

取1.3.3節(jié)孵育3 h的蠟樣芽孢桿菌懸液4 ℃、4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2～7.4，0.01 mol/L）洗滌2 次，得到菌體沉淀。采用Annexin V-APC/PI試劑盒進行染色，通過流式細胞儀進行熒光檢測。

1.3.5 蠟樣芽孢桿菌形態(tài)觀察

取1.3.3節(jié)孵育3 h的蠟樣芽孢桿菌懸液4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，隨后加入1 mL質(zhì)量分數(shù)3%戊二醛溶液以固定細胞。

掃描電子顯微鏡觀察：取固定的細胞依次用不同體積分數(shù)（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）乙醇溶液進行梯度洗脫，每次10 min，隨后進行臨界點干燥，真空鍍金，最后使用掃描電子顯微鏡觀察蠟樣芽孢桿菌的立體形態(tài)。

透射電子顯微鏡觀察：取固定細胞依次用不同體積分數(shù)（分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）丙酮溶液進行梯度洗脫，每次10 min，然后包埋、切片、染色，最后用透射電子顯微鏡進行剖面觀察。

1.3.6 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)代謝的影響

參考文獻[17]的方法并略作修改，探究青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)代謝的影響。將含有0.5 MIC青花椒精油的蠟樣芽孢桿菌懸液（1×10CFU/mL）置于搖床（180 r/min、37 ℃）孵育3 h，以未加入青花椒精油的菌懸液作為空白對照。孵育結(jié)束后12 000 r/min、4 ℃離心5 min收集菌體，然后進行冷凍干燥，將凍干后的菌體研磨成粉。然后將100 mg菌粉置于1.5 mL離心管中，并加入1 mL異丙醇-乙腈-水溶液（體積比為3∶2∶2）振蕩提取1 min。提取后12 000 r/min、4 ℃離心5 min，吸取200 μL上清液進行冷凍干燥。在凍干后的固體中加入100 μL甲氧銨鹽試劑（20 mg/mL），并在30 ℃水浴孵育90 min，然后加入50 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在37 ℃水浴孵育30 min。然后取1 μL進行GC-MS分析。

GC-MS條件：柱溫箱起始溫度為80 ℃，保持2 min，隨后以10 ℃/min升高到300 ℃，保持6 min，其余條件與1.3.1節(jié)相同。

化合物鑒定和相對定量方法與1.3.1節(jié)相同。采用MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca）數(shù)據(jù)處理平臺對代謝物的相對含量進行正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），選取變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）≥1，差異倍數(shù)≥1.5，≤0.05的代謝物作為差異代謝物，并對其進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析及注釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復3 次，結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用Origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花椒精油的化學組成

青花椒精油的化學組成如表1所示、共鑒定出18 個化合物、占總峰面積的89.22%。其中主要包括芳樟醇（（30.69±0.17）%）、-檸檬烯（（14.55±0.12）%）、偽檸檬烯（（9.08±0.24）%）、4-松油烯醇（（3.95±0.14）%）、-月桂烯（（3.88±0.10）%）、-松油醇（（3.69±0.08）%）、橙花叔醇（（3.34±0.07）%）、大牛兒烯D（（2.84±0.10）%）、乙酸芳樟酯（（2.83±0.07）%）和-蒎烯（（2.67±0.03）%）。相似地，Diao Wenrui、Yang Xiaogen等的研究也表明芳樟醇和-檸檬烯是青花椒精油中主要的揮發(fā)性成分。青花椒精油中的多種化合物已經(jīng)被證實具有抑菌活性。其中芳樟醇已被報道能夠通過破壞細胞膜，擾亂胞內(nèi)代謝，影響關(guān)鍵酶活力等方式抑制銅綠假單胞菌（）和腐敗希瓦氏菌（）。由茶樹葉和末端小枝分離得到的4-松油烯醇能夠?qū)Χ喾N人類致病性念珠菌（）產(chǎn)生抑制效果。-檸檬烯具有廣譜的抑菌特性，能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌（）等多種病原菌，同時也對黃曲霉（）、黑曲霉（）和釀酒酵母（）等多種真菌具有抑制作用。此外，-蒎烯、-水芹烯、4-蒈烯、-松油醇和石竹烯均被證明具有抑菌活性。綜上，青花椒精油的化學組成是其具有抑菌能力的基礎(chǔ)。

表1 青花椒精油的化學組成Table 1 Chemical composition of green huajiao essential oil

2.2 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性

分別采用終質(zhì)量濃度16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL青花椒精油處理蠟樣芽孢桿菌，結(jié)果顯示青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌的MIC和MBC分別為2.0、4.0 mg/mL。Diao Wenrui等發(fā)現(xiàn)青花椒精油對表皮葡萄球菌（）和枯草芽孢桿菌（均為革蘭氏陽性菌）的MBC均為5.0 mg/mL，但對鼠傷寒沙門氏菌（）和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌能力較差，推測與細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)，革蘭氏陰性菌外膜具有良好的親水表面，導致親脂化合物很難滲透。

2.3 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌細胞壁的影響

細胞壁對微生物在環(huán)境中的強度和活力起著至關(guān)重要的作用。AKP是一種位于細胞壁和細胞膜之間的胞內(nèi)酶，當細胞壁被破壞時，AKP會泄漏到細胞外。已有報道證實精油及相關(guān)成分通常先對細菌的細胞壁和細胞膜造成不可逆的損傷，從而起到抑菌作用。AKP活力測定結(jié)果如圖1所示，當使用MIC和MBC青花椒精油處理蠟樣芽孢桿菌后，AKP活力分別為（0.24±0.04）、（0.30±0.03）U/10cells，與空白組（（0.05±0.01）U/10cells）相比活力升高，表明青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌的細胞壁造成了損傷，從而導致AKP外泄。相似地，Tang Hui等研究發(fā)現(xiàn)黑胡椒提取物能夠破壞單核細胞增生李斯特菌（）和鼠傷寒沙門氏菌的細胞壁，從而導致AKP活力上升。

圖1 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞外AKP活力的影響Fig. 1 Effect of green huajiao essential oil on extracellular AKP activity of Bacillus cereus

2.4 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌細胞膜的影響

Diao Wenrui等報道青花椒精油能夠使表皮葡萄球菌細胞膜裂解，胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而抑制其活性。本實驗采用Annexin V-APC/PI雙染色法對不同質(zhì)量濃度青花椒精油處理的蠟樣芽孢桿菌進行流式細胞儀分析。如圖2所示，熒光信號主要集中在Q2和Q3象限，表明蠟樣芽孢桿菌未能與Annexin V-APC結(jié)合，這可能與革蘭氏陽性細菌的細胞壁較厚有關(guān)。此外，CK組、MIC處理組和MBC處理組的壞死細胞比例（APC/PI）分別為（2.15±0.32）%、（97.77±0.98）%和（98.93±0.26）%。本研究結(jié)果表明，MIC和MBC青花椒精油處理能夠破壞細胞膜完整性，并殺死絕大部分蠟樣芽孢桿菌。

圖2 青花椒精油處理蠟狀芽孢桿菌細胞的流式細胞術(shù)測定結(jié)果Fig. 2 Flow cytometric analysis of B. cereus cells treated with green huajiao essential oil

2.5 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌形態(tài)的影響

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，CK組的蠟樣芽孢桿菌細胞排列緊密，細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)完整。而經(jīng)MIC青花椒精油處理后，細胞嚴重皺縮，細胞膜破裂。經(jīng)MBC青花椒精油處理后，蠟樣芽孢桿菌細胞膜破損嚴重，細胞邊界模糊不清，出現(xiàn)大量聚集。

圖3 青花椒精油處理蠟狀芽孢桿菌細胞的掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic images of B. cereus cells treated with green huajiao essential oil

透射電子顯微鏡結(jié)果如圖4所示，未使用青花椒精油處理的蠟樣芽孢桿菌細胞結(jié)構(gòu)完整。當經(jīng)過MIC處理后，細胞壁和膜破損，胞內(nèi)物質(zhì)流出嚴重，但是其內(nèi)生孢子仍具完整的結(jié)構(gòu)。當質(zhì)量濃度提高到MBC時，細胞破損嚴重，細胞壁和細胞膜脫落，且內(nèi)生孢子出現(xiàn)孔洞。推測高質(zhì)量濃度的青花椒精油能夠?qū)ο灅友挎邨U菌的內(nèi)生孢子結(jié)構(gòu)造成影響。

圖4 青花椒精油處理蠟狀芽孢桿菌細胞的透射電子顯微鏡圖Fig. 4 Transmission electron microscopic images of B. cereus cells treated with green huajiao essential oil

2.6 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)代謝的影響

圖5 青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)代謝的影響Fig. 5 Effect of green huajiao essential oil on intracellular metabolism of B. cereus

2.6.1 細胞膜損傷相關(guān)代謝物分析結(jié)果

流式細胞術(shù)和微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果已經(jīng)證明青花椒精油能夠?qū)ο灅友挎邨U菌的細胞膜造成損傷。細胞膜損傷相關(guān)代謝物相對含量變化如圖6所示，從代謝水平上分析，當使用0.5 MIC青花椒精油處理蠟樣芽孢桿菌后，其胞內(nèi)的脯氨酸相對含量相較于對照組，上升5.03 倍（圖6L）。脯氨酸是一種具有多種功能的代謝物，其在滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除和膜完整性保護等方面發(fā)揮著重要作用。該結(jié)果間接表明了青花椒精油能夠?qū)ο灅友挎邨U菌細胞膜造成影響。此外，與CK組相比，0.5 MIC處理組未檢測到鳥氨酸（圖6M），推測鳥氨酸在環(huán)脫氨酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼嵋詰獙毎p傷。相似地，Liu Miaomiao等發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌經(jīng)過澀柿單寧處理后，細胞膜遭到破壞，胞內(nèi)脯氨酸含量及相關(guān)基因顯著上調(diào)。

此外，脂肪酸是細胞膜的重要組成部分，其除了作為能量來源外，還具有重要的生物和結(jié)構(gòu)作用。如圖6A～K所示，共檢測出11 種脂肪酸，其中包括9 種飽和脂肪酸和2 種不飽和脂肪酸，其相對含量均明顯下降。已有研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜的通透性和流動性取決于細胞膜所含脂肪酸的飽和性。雖然本研究中所有脂肪酸的相對含量均下降，但是總不飽和脂肪酸與總飽和脂肪酸相對含量的比值由0.054 3增加到0.145 9，表明青花椒精油能夠改變蠟樣芽孢桿菌中脂肪酸組成，從而影響細胞膜的流動性和通透性。相似地，di Pasqua等發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理大腸桿菌后，其胞內(nèi)不飽和度升高，推測肉桂醛通過上調(diào)去飽和酶將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成不飽和脂肪酸，引起細胞膜流動性的增加。

圖6 細胞膜損傷相關(guān)代謝物相對含量變化Fig. 6 Changes in cell membrane damage-related metabolites

2.6.2 能量代謝限制

糖酵解、檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈是細胞提供能量的重要途徑。其中檸檬酸循環(huán)是大多數(shù)代謝通路的主要中樞途徑，為糖類、脂肪酸和氨基酸的氧化分解等代謝過程提供前體。在本研究中，檸檬酸和蘋果酸的相對含量降低，而琥珀酸和谷氨酸的相對含量上升（圖7），表明青花椒精油處理后蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)的檸檬酸循環(huán)發(fā)生紊亂。琥珀酸是檸檬酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，其在琥珀酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)換為富馬酸。在本研究中，琥珀酸的相對含量升高可能是青花椒精油抑制了蠟樣芽孢桿菌琥珀酸脫氫酶活力，導致其暫時性積累。此外，谷氨酸相對含量的升高也表明檸檬酸循環(huán)受到了影響，通常情況下谷氨酸與檸檬酸循環(huán)產(chǎn)物-酮戊二酸呈高度平衡狀態(tài)，檸檬酸循環(huán)的抑制會導致谷氨酸積累。乳酸是糖酵解的最終產(chǎn)物，其含量能夠反映糖酵解活性。在本研究中，乳酸相對含量降低，表明青花椒精油對蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)糖酵解途徑具有抑制作用。

圖7 青花椒精油對蠟狀芽孢桿菌檸檬酸循環(huán)通路的影響Fig. 7 Effect of green huajiao essential oil on the citric acid circulation pathway of B. cereus

2.6.3 氨基酸代謝紊亂

此外，如圖8所示，青花椒精油處理蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)氨基酸的合成和代謝途徑也受到了干擾。與對照組相比，在被鑒定到的15 種氨基酸中有10 種相對含量降低，5 種相對含量升高。KEGG富集結(jié)果顯示青花椒精油顯著影響了氨酰tRNA生物合成的中間體。氨酰tRNA參與核糖體依賴蛋白質(zhì)的合成和基本初級代謝過程，其作為適配體分子，連接mRNA的密碼子和指定的氨基酸，在蛋白質(zhì)的生物合成中起關(guān)鍵作用。對氨酰tRNA合成途徑影響相關(guān)蛋白合成途徑造成干擾，就會導致細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導受到影響。與對照組相比，青花椒精油處理蠟樣芽孢桿菌胞內(nèi)亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸3 種支鏈氨基酸的相對含量降低。支鏈氨基酸是代謝活動中不可缺少的代謝產(chǎn)物，在新分子和細胞的生物合成過程中提供能量和前體。Shu Huizhen等也發(fā)現(xiàn)3-蒈烯能夠擾亂熒光假單胞菌（）胞內(nèi)的支鏈氨基酸的代謝。Hu Zhenyang等通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)使用紫蘇精油處理黃曲霉會導致與3 種支鏈氨基酸降解相關(guān)的基因表達上調(diào)，推測纈氨酸和異亮氨酸降解導致丙酸產(chǎn)生，從而損傷黃曲霉孢子。

圖8 青花椒精油對蠟狀芽孢桿菌氨基酸代謝相關(guān)通路的影響Fig. 8 Effect of green huajiao essential oil on amino acid metabolism pathways of B. cereus

3 結(jié) 論

本研究通過多種技術(shù)方法對青花椒精油的化學組成及抑菌活性及機理進行了探討。GC-MS分析結(jié)果表明烯、醇和酯類物質(zhì)是青花椒精油化學組成中的主要成分，其中多種化合物已被報道具有抑菌活性。以蠟樣芽孢桿菌作為研究對象時，青花椒精油表現(xiàn)出良好的抑菌效果，其MIC和MBC分別為2.0、4.0 mg/mL。為了探究其抑菌機理，本實驗首先測定AKP活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過青花椒精油處理后，AKP活力上升，表明蠟樣芽孢桿菌的細胞壁被破壞。同時，本實驗進行了Annexin V-APC/PI雙染色法流式細胞術(shù)分析以及透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青花椒精油能夠破壞蠟樣芽孢桿菌細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)，導致胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出，且MBC青花椒精油處理還能對內(nèi)生孢子產(chǎn)生顯著影響。本實驗基于衍生化的方法在代謝水平上闡釋了青花椒精油潛在的抑菌機制，結(jié)果顯示青花椒精油能夠顯著影響蠟樣芽孢桿菌脂肪酸的組成，進而改變其細胞膜的通透性，此外，其還能使蠟樣芽孢桿菌能量代謝和氨基酸代謝紊亂，從而起到抑菌效果。這些結(jié)果可為青花椒資源的充分利用和進一步開發(fā)以青花椒為原料的新型抗菌藥物提供參考。