動脈炎病毒PRRSV和EAV的Nsp4蛋白對mTANK蛋白的降解

吳 磊, 袁 旭, 洪錦璇, 陳 葉, 李訓(xùn)良, 宋中寶

[1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院);2.閩臺動物病原生物學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002]

動脈炎病毒科屬套式病毒目,含有5個成員，分別為馬動脈炎病毒(equine infectious arteritis virus, EAV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猴出血熱病毒(SHFV)、鼠乳酸脫氫酶增高病毒(LDV)和負(fù)鼠病病毒(WPDV)[1-2].其中，EAV和PRRSV是獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中非常重要的病原體，給世界的馬產(chǎn)業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失.動脈炎病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為動脈病變、水腫、嚴(yán)重的呼吸道癥狀或肺炎以及妊娠動物流產(chǎn)[3].種馬對EAV極為易感，持續(xù)性感染的種馬還可通過精液感染母馬，引起妊娠母馬流產(chǎn)；EAV感染馬駒可引起致命性的支氣管間質(zhì)性肺炎或肺腸綜合癥[4].PRRSV感染主要引起母豬繁殖障礙、仔豬死亡以及各年齡段豬不同程度的呼吸癥狀[5].作為動脈炎病毒，EAV和PRRSV具有相似的生物學(xué)特性，如巨噬細(xì)胞嗜性和復(fù)制策略.兩種病毒都可在宿主體內(nèi)建立持續(xù)性感染，急性感染后，病毒通常不能被完全消除，并且會繼續(xù)在淋巴組織(PRRSV)或生殖道(EAV)中低水平復(fù)制[3].其主要原因是病毒具有強大的免疫抑制能力.盡管病毒感染早期能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體，但這些抗體并不具有中和作用，而具有保護(hù)作用的中和抗體往往產(chǎn)生得較晚[6].此外，EAV和PRRSV感染還可下調(diào)宿主的先天性免疫應(yīng)答，從而引起機體的免疫抑制.

動脈炎病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小為12～16 kb，包含10～12個開放性閱讀框(open reading frames, ORFs)(ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7、ORF5a)[5].ORF1a和ORF1b位于基因組的5′端，負(fù)責(zé)編碼兩個大的多聚蛋白前體pp1a和pp1ab.這些多聚蛋白可被ORF1a編碼的蛋白酶裂解成成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins, Nsps).其中，動脈炎病毒ORF1a編碼的Nsp4蛋白具有木瓜樣3C蛋白酶活性，主要負(fù)責(zé)切割病毒的多聚蛋白前體形成成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白[7].PRRSV Nsp4蛋白的酶活性位點分別位于E39、E64、E118處，EAV Nsp4蛋白的酶活性位點分別位于E39、E65、E120處，任一位點的突變都將導(dǎo)致蛋白酶活性的喪失[4].動脈炎病毒Nsp4蛋白在加工多聚蛋白pp1a和pp1ab形成非結(jié)構(gòu)蛋白指導(dǎo)病毒基因復(fù)制和亞基因組mRNA(sg-mRNA)的合成過程中發(fā)揮著必不可少的作用.

TRAF家族成員相關(guān)NF-κB激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator, TANK)又稱I-TRAF，能夠負(fù)調(diào)控TRAF2和TRAF6介導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活[8-9].此外，也有研究指出TANK可與IKK-ε、TBK1互作調(diào)控I型干擾素信號通路[10].

本研究以PRRSV Nsp4蛋白為誘餌，利用質(zhì)譜和免疫沉淀技術(shù)確定其宿主細(xì)胞中的靶蛋白，進(jìn)一步揭示病毒與宿主之間的互作關(guān)系，對于闡明病毒的致病性與免疫具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料

Marc-145細(xì)胞和高致病性PRRSV BB0907毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授饋贈；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pCAGGS-HA質(zhì)粒和HEK293T細(xì)胞由本實驗室保存.

2×Phenta Mix高保真酶、2×Taq Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊公司；T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、KpnⅠ和XhoⅠ，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和RNA提取試劑盒購自北京天根公司；Flag鼠單抗、HA鼠單抗和β-actin鼠單抗購自Proteintech公司；TANK兔多抗購自北京博奧森公司；MG-132、NH4Cl和Z-VAD-FMK購自上海碧云天公司；3-MA購自CST公司.

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 收集Marc-145細(xì)胞和PRRSV毒株，按照RNA提取試劑盒說明書操作分別提取細(xì)胞和病毒的RNA，并測定濃度.按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，置-20 ℃保存.

1.2.2 引物設(shè)計與合成 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中猴源TANK (monkey TANK, mTANK)基因的mRNA序列(序列號：XM_007965137.2)和BB0907 Nsp4的基因序列(序列號：HQ315835.1)分別設(shè)計引物及其突變體引物，送北京擎科公司合成.

1.2.3 PCR擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建 PCR反應(yīng)體系50 μL:25 μL 2×Phenta Mix,上、下游引物各2 μL，20 μL ddH2O，1 μL 100 ng·μL-1模板.PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán).PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收.回收的目的基因和載體質(zhì)粒pCAGGS經(jīng)內(nèi)切酶SacⅠ/KpnⅠ酶切后回收，利用T4連接酶于25 ℃連接30 min，并轉(zhuǎn)化DH5α，于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h后涂布含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜.次日，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)16 h，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送上海生工公司測序鑒定.經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-mTANK-HA、pCAGGS-GST-HA和pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag.pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒由上海生工公司合成.

1.2.4 免疫沉淀 將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag質(zhì)粒、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒和空載體pCAGGS-HA分別與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞裂解液，于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清加入1 μg小鼠IgG和20 μL Protein A+G，于4 ℃緩慢搖晃4 h，去除非特異性吸附.于4 ℃、1 000×g離心5 min，取上清加入1 μg Flag單抗，于4 ℃緩慢搖晃12 h，加入40 μL蛋白A+G繼續(xù)搖晃4 h，于4 ℃、1 000×g離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，最后用100 μL PBS重懸沉淀.采用Western blot分析蛋白的互作情況.

1.2.5 Nsp4對mTANK表達(dá)影響的檢測 將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒分別與pCAGGS-mTANK-HA、pCAGGS-GST-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞裂解液，用BCA試劑盒測定濃度后，采用Western blot分析Nsp4對mTANK表達(dá)的影響.

1.2.6 PRRSV感染對mTANK表達(dá)影響的檢測 將Marc-145細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞板中，待次日細(xì)胞長滿單層，接種PRRSV BB0907毒株1.0 MOI，分別在病毒感染后12、24、36 h收取細(xì)胞裂解樣品，采用Western blot分析PRRSV對mTANK表達(dá)的影響.

1.2.7 抑制劑處理對Nsp4降解mTANK的檢測 將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒分別與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后，分別用抑制劑MG-132(10 μmol·L-1)、NH4Cl(10 mmol·L-1)、Z-VAD-FMK(20 μmol·L-1)、3-MA(5 mmol·L-1)處理細(xì)胞12 h，收取細(xì)胞裂解樣品，采用Western blot分析Nsp4對mTANK表達(dá)的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV和EAV的Nsp4與mTANK的互作

將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，24 h后收取細(xì)胞樣進(jìn)行免疫沉淀，采用Western blot檢測沉淀物，并將沉淀物送上海歐易公司進(jìn)行質(zhì)譜分析.圖1A顯示，免疫沉淀物中各蛋白正常表達(dá).質(zhì)譜分析結(jié)果如表1所示，本研究選擇了評分最高的TANK蛋白進(jìn)行深入研究.為了驗證質(zhì)譜的結(jié)果，將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，利用免疫沉淀驗證兩者的互作關(guān)系.結(jié)果(圖1B)顯示，mTANK可以被PRRSV Nsp4沉淀.為了研究EAV Nsp4是否也可沉淀mTANK，將pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞.結(jié)果(圖1C)顯示，EAV Nsp4成功下拉mTANK.以上結(jié)果證明，PRRSV和EAV的Nsp4可與宿主蛋白mTANK互作.

A：將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，使用Flag單抗做免疫沉淀，采用Western blot檢測蛋白表達(dá)水平；將pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒分別與pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag(B)、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag(C)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，使用Flag單抗做免疫沉淀，采用Western blot檢測蛋白表達(dá)水平(+表示轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒，-表示沒有轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒).

表1 免疫沉淀樣品質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2 PRRSV和EAV的Nsp4對mTANK的降解

前期研究表明，Nsp4-Flag與mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞時，mTANK蛋白的表達(dá)量總是少于對照組(圖1)，推測Nsp4可能具有抑制mTANK表達(dá)的作用.為了驗證這個猜想，將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag質(zhì)粒、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒、空載體pCAGGS-HA分別與pCAGGS-mTANK-HA、pCAGGS-GST-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，采用Western blot檢測每個蛋白的表達(dá)水平.結(jié)果顯示：PRRSV Nsp4對mTANK具有降解作用且呈劑量依賴關(guān)系，但對GST蛋白并沒有作用(圖2A、2B)；同樣地，EAV Nsp4也具有相同的作用(圖2C、2D).此外，在病毒水平上檢測PRRSV感染后不同時間點mTANK的表達(dá)情況，結(jié)果(圖2E)顯示，PRRSV感染可降低mTANK的表達(dá).

將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag質(zhì)粒以不同劑量分別與pCAGGS-mTANK-HA(A)、pCAGGS-GST-HA(B)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞樣本檢測蛋白表達(dá)水平；將pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒以不同劑量分別與pCAGGS-mTANK-HA(C)、pCAGGS-GST-HA(D)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞樣本檢測蛋白表達(dá)水平；E：用PRRSV毒株1.0 MOI感染Marc-145細(xì)胞，分別在感染后的12、24、36 h檢測mTANK表達(dá)水平(+表示轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒，-表示沒有轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒).

2.3 PRRSV和EAV的Nsp4依賴酶活性對mTANK的降解

為了研究Nsp4降解mTANK的途徑，用蛋白酶體抑制劑MG-132、凋亡途徑抑制劑Z-VAD-FMK、溶酶體抑制劑NH4Cl和自噬抑制劑3-MA分別處理共轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞，采用Western blot檢測mTANK蛋白的表達(dá)水平.結(jié)果(圖3A、3B)顯示，4種抑制劑處理都不影響Nsp4對mTANK的降解作用，說明Nsp4降解mTANK與泛素蛋白酶體途徑、凋亡途徑、自噬溶酶體途徑無關(guān).

動脈炎病毒Nsp4具有3C樣蛋白酶活性，為了驗證Nsp4降解mTANK是否與酶活性有關(guān)，采用點突變試劑盒分別構(gòu)建了PRRSV Nsp4蛋白E39A、E64A、E118A和EAV Nsp4蛋白E39A、E65A、E120A的突變體質(zhì)粒[4].將野生型質(zhì)粒pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag及突變體質(zhì)粒分別與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，結(jié)果(圖3C、3D)表明，PRRSV和EAV Nsp4蛋白的酶活性喪失后無法降解mTANK，說明Nsp4降解mTANK依賴于3C樣蛋白酶活性.

盡管PRRSV和EAV的Nsp4可以降解mTANK，但未發(fā)現(xiàn)mTANK被降解產(chǎn)生的片段，猜測Nsp4降解mTANK的靶點位于C端，隨后將HA標(biāo)簽放在mTANK蛋白的N端構(gòu)建了pCAGGS-HA-mTANK質(zhì)粒.將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag和pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒分別以不同劑量與pCAGGS-HA-mTANK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，結(jié)果(圖3E、3F)顯示，EAV Nsp4降解mTANK后在30和25 ku附近出現(xiàn)兩條清晰的條帶，PRRSV Nsp4降解mTANK后在30 ku附近有一條清晰的條帶.

將pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag(A)、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag(B)質(zhì)粒分別與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后分別使用抑制劑MG-132、NH4Cl、Z-VAD-FMK、3-MA處理細(xì)胞12 h，收取細(xì)胞樣品采用Western blot檢測蛋白表達(dá)水平；將pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag(C)、pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag(D)及其突變體質(zhì)粒分別與pCAGGS-mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后采用Western blot檢測蛋白表達(dá)水平；將pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag(E)、pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag(F)質(zhì)粒分別與pCAGGS-HA-mTANK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后采用Western blot檢測蛋白表達(dá)水平(+表示轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒，-表示沒有轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒).

3 討論

動脈炎病毒PRRSV和EAV是養(yǎng)豬業(yè)和馬產(chǎn)業(yè)中重要的病原體，給世界的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無有效的疫苗用于這些動脈炎病毒的防控.動脈炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4含有兩個胰凝乳蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域，分別為C端α/β結(jié)構(gòu)域和小的保守結(jié)構(gòu)域，具有3C樣絲氨酸蛋白酶活性，在加工多聚蛋白pp1a和pp1ab、釋放非結(jié)構(gòu)蛋白、指導(dǎo)基因組復(fù)制及亞基因組mRNA(sg-mRNA)合成過程中發(fā)揮了重要的作用[7,11-12].

研究表明：動脈炎病毒PRRSV和EAV具有強大的免疫逃逸策略，其中，Nsp4是病毒發(fā)生免疫抑制的最重要蛋白之一[4,13]；PRRSV Nsp4可通過其酶活性切割NF-κB激活必需分子NEMO和MAVS，下調(diào)IFN-β的水平[14-15]；PRRSV Nsp4可切割STAT2蛋白上的E719，阻斷JAK-STAT信號通路的信號傳遞[16]；同樣地，EAV Nsp4也可靶向NEMO的4個氨基酸位點(E166、 E171、Q205、E349)降解NEMO，從而抑制宿主的I型IFN反應(yīng)[4]；此外，Nsp4還可靶向ISGs阻斷抗病毒作用，PRRSV Nsp4可作用于干擾素誘導(dǎo)蛋白DCP1a的第238位谷氨酸位點，通過3C樣蛋白酶活性切割DCP1a，降低DCP1a的抗病毒活性[17].本課題組前期研究表明，干擾素誘導(dǎo)ZAP蛋白抑制PRRSV的復(fù)制，然而，病毒利用Nsp4降解ZAP蛋白可致弱宿主產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)[18-19].除此之外，有研究指出，腦心肌炎病毒(EMCV)的3C蛋白可依賴其3C樣蛋白酶活性切割TANK蛋白以調(diào)控宿主的NF-κB信號通路[20].而Qian et al[21]指出,塞內(nèi)卡病毒(SVV)的3C蛋白也可通過其蛋白酶活性切割宿主的TANK蛋白以調(diào)控干擾素的表達(dá).綜上說明，3C樣蛋白酶活性在病毒調(diào)控宿主先天性免疫過程中發(fā)揮了十分重要的作用.

本研究采用表達(dá)PRRSV Nsp4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，通過免疫沉淀技術(shù)下拉宿主蛋白，并結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)PRRSV Nsp4可與宿主蛋白mTANK互作，且同為動脈炎病毒科的EAV的Nsp4也可與mTANK互作.表達(dá)PRRSV和EAV的Nps4的質(zhì)粒和mTANK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞時，mTANK蛋白的表達(dá)水平顯著降低，且Nps4并不影響GST蛋白的表達(dá).本研究還檢測了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后不同時間點mTANK的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可降解mTANK.為了研究Nsp4降解mTANK的機制，本研究利用蛋白酶體抑制劑MG-132、凋亡途徑抑制劑Z-VAD-FMK、溶酶體抑制劑NH4Cl和自噬抑制劑3-MA分別處理共轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑處理并不影響Nsp4對mTANK的降解.為探究Nsp4降解mTANK是否依賴于3C樣蛋白酶活性，本研究檢測了酶活性缺失的Nsp4對mTANK表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Nsp4無法降解mTANK，說明Nsp4對mTANK的降解作用依賴于3C樣蛋白酶活性.然而，本研究沒有檢測到mTANK被降解產(chǎn)生的條帶，因而猜測Nsp4的作用靶點靠近C端，降解產(chǎn)生的條帶太小以至于無法檢測到，因此構(gòu)建了N端標(biāo)簽的pCAGGS-HA-mTANK質(zhì)粒.當(dāng)pCAGGS-PRRSV-Nsp4-Flag、pCAGGS-EAV-Nsp4-Flag質(zhì)粒分別與pCAGGS-HA-mTANK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞時，mTANK被切割產(chǎn)生了明顯的條帶，分別位于30和25～30 ku附近.PRRSV和EAV的Nsp4的3C樣蛋白酶活性可特異性識別底物P1位的谷氨酸 (E)及P1′位的丙氨酸(A)、甘氨酸 (G)或絲氨酸(S)，并在E位點切割從而降解底物蛋白.此外，EAV Nsp4還可識別底物P1位的谷氨酰胺(Q)從而切割底物蛋白.本研究結(jié)果尚未解析Nsp4降解TANK的氨基酸位點，后續(xù)有待進(jìn)一步探究.

綜上，本研究通過免疫沉淀和質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了動脈炎病毒PRRSV和EAV的Nsp4的互作蛋白，并發(fā)現(xiàn)Nsp4以3C樣蛋白酶活性依賴方式降解mTANK，進(jìn)一步豐富了動脈炎病毒與宿主之間互作的分子機制.