樣本量與東方蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性參數(shù)穩(wěn)定性的關系

周姝婧, 朱翔杰, 徐新建, 蘇顯冰, 蔡宗兵, 周冰峰

[1.福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學蜜蜂研究所，福建 福州 350002]

遺傳多樣性對生物的生存和發(fā)展起到重要作用，是種群適應環(huán)境變化的基礎，并將長期及動態(tài)地影響進化潛力及適應不同環(huán)境的能力.合理、有效地評估種群遺傳多樣性水平是種群遺傳學、遺傳多樣性、保護生物學等學科的重要工作[1-2].微衛(wèi)星標記是相對中性的共顯性標記，具有多態(tài)性高、擴增穩(wěn)定和高效、易于擴增，且價格較低等優(yōu)點.在分子生物學實驗技術快速發(fā)展的背景下，微衛(wèi)星標記仍廣泛用于動植物遺傳多樣性研究，種群遺傳分化及相關的分化機制研究，種群的遺傳結構與特征、品種鑒定研究，以及評估外來種群對本土種群基因滲透程度等研究[3-5].

蜜蜂遺傳多樣性研究是進行蜜蜂遺傳資源保護和利用的基礎，微衛(wèi)星標記在蜜蜂遺傳多樣性領域上的應用非常普遍.樣本量對蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性參數(shù)的影響尚未見報道，該領域研究所需的樣本量始終處于含糊狀態(tài).對1998—2021年公開發(fā)表的論文進行樣本量統(tǒng)計的結果顯示，蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性研究使用的樣本量從個位數(shù)到百群以上，多為11～60群.其中，樣本量為10群以下約占6.4%，11～20群約占14.4%，21～30群約占18.3%，31～40群約占10.2%，41～50群約占16.0%，51～60群約占17.3%，61～70群約占7.3%，71～80群約占3.5%，81～90群約占2.0%，91～100群約占0.9%，100群以上約占3.8%[6-44].隨著對微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性認識和研究的深入，研究者意識到樣本量不足可能無法充分體現(xiàn)樣本代表區(qū)域的遺傳多樣性水平，因此，樣本量小于30群的情況從2010年前的41%下降至近5年的12%.在實際樣本采集中，常常有許多困難使得樣本難以采集.因此，選擇適當大小的樣本量，對于提高遺傳多樣性研究的效率有著非常重要的意義.

本研究對5個180群樣本量的東方蜜蜂種群，設置15個樣本量梯度進行重復抽樣，探討在遺傳多樣性研究中，各遺傳多樣性常用參數(shù)在不同樣本量時與總體的關系，以及樣本量對遺傳多樣性參數(shù)檢測穩(wěn)定性的影響.探索蜜蜂遺傳多樣性研究的最適宜樣本量，可為其他生物的種群遺傳學研究提供采集策略借鑒.

1 材料與方法

1.1 樣本的采集與保存

在東方蜜蜂分布面積大、蜂群保有量高的陜西省、重慶市、江西省、廣西壯族自治區(qū)和保有量不高的臺灣省開展樣本采集.每個省份為一個種群，每個種群的樣本量為180群.供試樣本以野生蜂群或半野生原始飼養(yǎng)蜂群為主，采樣蜂場無引種、選育行為，可代表當?shù)孛鄯溥z傳結構和多樣性.

1.2 基因組提取與微衛(wèi)星DNA擴增

每個蜂群取1只工蜂提取全基因組進行微衛(wèi)星DNA擴增.微衛(wèi)星標記利用ExTaq Hot Start Version擴增試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)進行36個微衛(wèi)星標記擴增試驗，引物設計、PCR擴增體系和擴增程序參考文獻[11,14]的方法進行.成功擴增出目的條帶的樣品，送至北京金唯智公司進行基因分型.

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 抽樣與微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性參數(shù)的計算 試驗所用的5個種群，均以10群為間隔，設置15個梯度樣本量(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150群)，采用簡單隨機抽樣法直接抽樣，每個梯度樣本量抽樣10次.

計算各種群微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性參數(shù).使用Mstool軟件計算等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)；使用FSTAT 2.9.3軟件計算稀疏化后的種群等位基因豐富度(Rs)；基于MsTools軟件得到的數(shù)據(jù)再利用Popgene1.31軟件計算香農(nóng)指數(shù)(I)和有效等位基因數(shù)(Ne).

1.3.2 統(tǒng)計分析 使用SPSS 24軟件對各種群微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性參數(shù)與樣本量進行相關性分析，并進行回歸分析和曲線擬合，探討樣本量與各參數(shù)的關系；使用單因素方差分析5個種群15個梯度樣本量及其總樣本量的參數(shù)，參數(shù)兩兩之間的顯著性采用多重比較Tukey方法檢驗.

2 結果與分析

2.1 樣本量與遺傳變異豐富度參數(shù)的關系

等位基因數(shù)和等位基因豐富度是反映種群遺傳變異豐富度的參數(shù).5個種群的等位基因數(shù)和等位基因豐富度均易受樣本量的影響，與樣本量呈極顯著正相關關系，相關系數(shù)(R2)為0.902～0.958.回歸分析和曲線擬合顯示，等位基因數(shù)、等位基因豐富度與樣本量呈顯著對數(shù)增長關系(圖1).等位基因數(shù)和等位基因豐富度在樣本量為10群時，分別達到各種群總樣本量的43%～59%和26%～58%；60群時，分別達到各種群總樣本量的74%～89%和72%～89%；150群時，分別達到各種群總樣本量的91%～100%和91%～99%.

圖1 樣本量與等位基因數(shù)、等位基因豐富度的相互關系

方差分析顯示，多樣性越高，能反映總體多樣性水平所需的樣本量就越大.多樣性最高的江西種群和廣西種群，樣本量為150群時的等位基因數(shù)、等位基因豐富度與總樣本量的差異顯著；陜西種群的等位基因豐富度在樣本量為140～150群時與總樣本量的差異不顯著；重慶種群的等位基因數(shù)在樣本量為130群以上時與總樣本量的差異不顯著，等位基因數(shù)在樣本量為120群以上時與總樣本量的差異不顯著；臺灣種群的等位基因數(shù)和等位基因豐富度在樣本量為150群以上時與總樣本量的差異不顯著.

2.2 樣本量與雜合度的關系

期望雜合度和觀察雜合度隨著樣本量的增加，檢測值會趨近總樣本量檢測值，更穩(wěn)定、準確地反應整個種群的遺傳雜合度(圖2A、2C).

樣本量為10群時，觀察雜合度占總樣本量的87%～111%，5個種群標準差均值為0.020 1；樣本量為150群時，觀察雜合度占總樣本量的99%～102%，標準差均值降至0.002 2(圖2B).標準差方差分析顯示，樣本量為70群以上的觀察雜合度標準差與150群的差異不顯著.

樣本量為10群時，期望雜合度占總樣本量的93%～109%，5個種群標準差均值為0.013 7；樣本量為150群時，期望雜合度占總樣本量的99%～102%，5個種群標準差均值為0.001 3(圖2D).標準差方差分析顯示，樣本量為40群以上的期望雜合度標準差與150群的差異不顯著.

圖2 樣本量與雜合度、雜合度標準差的相互關系

2.3 樣本量與有效等位基因數(shù)的關系

有效等位基因數(shù)與樣本量呈極顯著正相關關系，陜西、重慶、江西、廣西4個種群的有效等位基因數(shù)與樣本量的R2均在0.600 0以上，臺灣種群有效等位基因數(shù)與樣本量的R2為0.200 0.回歸分析和曲線擬合顯示，有效等位基因數(shù)與樣本量呈對數(shù)增長關系(圖3A).方差分析顯示，陜西種群樣本量為30群以上時的有效等位基因數(shù)與總樣本量的差異不顯著，重慶、江西種群樣本量為40群以上時的有效等位基因數(shù)與總樣本量的差異不顯著，廣西種群樣本量為50群以上時的有效等位基因數(shù)與總樣本量的差異不顯著，臺灣種群為10群以上的有效等位基因數(shù)與總樣本量的差異不顯著.有效等位基因數(shù)標準差在10～40群時下降明顯，40～140群時下降較為平緩(圖3B).標準差方差分析顯示，樣本量為40群以上的有效等位基因數(shù)與150群的差異不顯著.

圖3 樣本量與有效等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)標準差的相互關系

2.4 樣本量與多態(tài)信息含量的關系

5個種群的多態(tài)信息含量與樣本量呈極顯著正相關關系，R2為0.482～0.660.回歸分析和曲線擬合顯示，多態(tài)信息含量與樣本量呈對數(shù)增長關系(圖4A).方差分析顯示，多態(tài)信息含量最高的江西種群，樣本量為60群以上時的多態(tài)信息含量與總樣本量的差異不顯著；其次是陜西、重慶、廣西種群，樣本量為30群以上時的多態(tài)信息含量與總樣本量的差異不顯著；多態(tài)信息含量最低的臺灣種群，樣本量為20群以上時的多態(tài)信息含量與總樣本量的差異不顯著.標準差方差分析顯示，樣本量為80群以上時的多態(tài)信息含量標準差與150群的差異不顯著(圖4B).

圖4 樣本量與多態(tài)信息含量、多態(tài)信息含量標準差的相互關系

2.5 樣本量與香農(nóng)指數(shù)的關系

5個種群的香農(nóng)指數(shù)與樣本量均呈極顯著正相關關系，R2為0.699～0.762.回歸分析和曲線擬合顯示，香農(nóng)指數(shù)與樣本量呈對數(shù)增長關系(圖5A).方差分析顯示，樣本量為60群以上時的香農(nóng)指數(shù)與總樣本量的差異不顯著，均達到總樣本量的95%以上.標準差方差分析顯示，樣本量為70～140群的香農(nóng)指數(shù)標準差與150群的差異不顯著(圖5B).

圖5 樣本量與香農(nóng)指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)標準差的相互關系

3 討論

遺傳多樣性研究在使用微衛(wèi)星標記等共顯性分子標記時，常用7種遺傳多樣性參數(shù).由于每個參數(shù)反映的遺傳多樣性信息不同，能反映總體遺傳多樣性所需要的最小樣本量也不同.本次在東方蜜蜂遺傳多樣性的研究中，反映種群遺傳變異豐富度的等位基因數(shù)和等位基因豐富度等參數(shù)檢測的穩(wěn)定性，均隨著樣本量的增加而增強，樣本量為60群時能檢測到70%的等位基因豐富度，樣本量為150群時能檢測到91%以上的等位基因豐富度；反映種群遺傳變異均勻度的期望雜合度最小樣本量為40群，觀察雜合度的最小樣本量為70群，有效等位基因數(shù)的最小樣本量為40群，多態(tài)信息含量最小樣本量為60～80群；同時反映遺傳豐富度和均勻度的香農(nóng)指數(shù)最小樣本量為60～70群.因此，建議在充分保證樣本代表性的前提下，研究蜜蜂遺傳多樣性的樣本量最少60群，最好在80群以上.重點關注等位基因數(shù)和等位基因豐富度等參數(shù)的研究，樣本量應在150群以上；重點關注期望雜合度和有效等位基因數(shù)的研究，樣本量可在40群以上.

保護生物學和保育遺傳學領域，在沒有人為遷入的情況下，等位基因的豐富性比等位基因的均勻性更重要，等位基因數(shù)會決定生物在自然選擇下的生存極限[45].等位基因數(shù)以及稀疏化后的等位基因豐富度的參數(shù)模型就是從豐富度的角度解釋種群遺傳變異程度[46]，樣本量增加使得種群中的更多基因包括稀有基因被檢測到，因此在變異數(shù)量的檢測上受樣本量的影響極大.但研究中發(fā)現(xiàn)，這類標記除了直接受樣本量的影響外，還可能受到均勻度的間接影響.臺灣種群的特點是，種群數(shù)量較少，分布在臺灣全島，遺傳多樣性和遺傳結構受人工育王、蜂場轉地移動等人為因素的影響較小，在豐富度較低的同時均勻度也低，并存在大量的稀有等位基因.因此在研究豐富度相關參數(shù)時，臺灣種群的樣本量需要達到150群時才能代表總體.雖然這類標記在了解種群的等位基因數(shù)，設計、實施方案保護本土資源時非常重要，但仍需要與均勻度參數(shù)結合在一起來判斷遺傳多樣性水平.

種群遺傳變異均勻度的參數(shù)在樣本量增大時，偏離總體均勻度的程度會減小.期望雜合度、觀察雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量都與種群遺傳變異均勻度有關，是從等位基因比例的角度說明種群內遺傳變異的分布.雜合度是最常用的反映遺傳多樣性的參數(shù)，其中，期望雜合度可用在單倍體、二倍體和多倍體的研究中，因此被認為是遺傳多樣性的最適參數(shù)之一，已有研究認為樣本量對雜合度幾乎沒有影響[47-48].但本次對東方蜜蜂5個種群15個梯度樣本量抽樣10次的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)樣本量的增加使雜合度檢測的穩(wěn)定性增強，更能反映總體雜合度水平.樣本量為70群時的檢測值波動小，能穩(wěn)定反應種群整體觀察雜合度水平；樣本量為40群時就能穩(wěn)定反應種群整體期望雜合度水平.有效等位基因數(shù)也是從均勻度角度觀察遺傳多樣性水平，是種群純合體頻率的倒數(shù)，能很好地區(qū)分同樣的等位基因但頻率不同的種群.在種群雜合體較多時，江西、廣西、陜西、重慶種群的有效等位基因數(shù)均大于2.5，樣本量為40群時就能代表總體的有效等位基因數(shù)；而臺灣種群的遺傳多樣性較低，樣本量為10群時即可代表總體的有效等位數(shù).因奠基者效應、小種群、近交等因素導致純合子較多時，樣本量適當減少也能體現(xiàn)總體的有效等位基因數(shù).

香農(nóng)指數(shù)綜合考慮了等位基因數(shù)和等位基因頻率，是較為全面的反映遺傳多樣性指標.本研究中，香農(nóng)指數(shù)在樣本量為70群時即可代表總體多樣性水平.香農(nóng)指數(shù)除了受樣本量的影響外，參與研究的標記個數(shù)會影響結果.各種群的香農(nóng)指數(shù)需要在同樣的標記中才能有效比較.

東方蜜蜂遺傳多樣性研究，除了考慮樣本量外，還需要根據(jù)本物種特點制定合適的取樣方式.其他動物或昆蟲的研究，采樣策略需要考慮季節(jié)和性比對遺傳多樣性的影響[17].由于蜜蜂的生殖特點，同一蜂群的遺傳背景是由蜂王決定的，自然狀態(tài)下的蜂群一年以上才會換王，因此，季節(jié)對蜜蜂種群遺傳結構的影響不大；性比對蜜蜂遺傳多樣性的影響更小.蜜蜂是完全社會性昆蟲，雄性蜜蜂只在特定季節(jié)出現(xiàn)，且數(shù)量較少，因此，蜜蜂遺傳多樣性的研究樣本為雌性工蜂.蜜蜂是經(jīng)濟昆蟲，飼養(yǎng)數(shù)量很大，人為因素的干擾會影響對當?shù)孛鄯溥z傳多樣性評估的準確性.合理的采樣策略，需要避免人為因素的干擾，包括引種、人工育王、育種，得到的蜜蜂樣本才能準確地代表當?shù)氐淖匀环N群，可以準確地評估種群遺傳多樣性和遺傳結構，以便設計后續(xù)的保護和利用方案.