葡萄酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化

王印壯，段定定，丁玉峰，馬艷莉,,*，牟建樓,*，席曉麗，谷曉東，宋乾華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 473000）

食用植物酵素起源于日本，已有上百年歷史，20世紀(jì)初進入我國市場。已有研究表明，食用植物酵素富含多種生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫以及解酒護肝等功效。隨著人們健康意識的提高，大眾對食用植物酵素產(chǎn)品的關(guān)注度越來越高。根據(jù)我國工業(yè)和信息化部制定的QB/T 5323—2018《植物酵素》標(biāo)準(zhǔn)，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類使用的酵素產(chǎn)品。在其制備工藝中起關(guān)鍵作用的是各種微生物，通過微生物的發(fā)酵作用將原料中的物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化，形成代謝產(chǎn)物釋放于酵素之中，使其具有豐富的風(fēng)味物質(zhì)，并且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種生理活性物質(zhì)以及發(fā)酵微生物大多為益生菌，從而又使其具有功能性。目前，市場上的酵素產(chǎn)品多以自然發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵過程不易控制，易染雜菌且發(fā)酵時間較長，不易滿足日益擴大的市場需求和實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此，條件可控且穩(wěn)定的接種發(fā)酵技術(shù)得到發(fā)展。莫大美等以玫瑰花為原料，接種酵母、乳酸菌和巴氏醋桿菌發(fā)酵制備酵素，研制出一種具有玫瑰花色澤和香氣、口感極佳、超氧化物歧化酶活性高的玫瑰花酵素產(chǎn)品。洪厚勝等以葡萄果渣、糖蜜等為原料，采用響應(yīng)面法，優(yōu)化接種酵母菌、醋酸菌以及乳酸菌發(fā)酵酵素工藝，生產(chǎn)出富含多種有機酸、香氣成分以及色澤亮麗、口感、滋味均佳的酵素產(chǎn)品。在利用接種發(fā)酵技術(shù)制備酵素時，研究發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化規(guī)律，對酵素產(chǎn)品的品質(zhì)提升及發(fā)酵終點的判定具有重要意義。陳英等以蔬菜、水果、菌類等為原料，接種酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發(fā)酵制備酵素，對發(fā)酵過程中微生物的數(shù)量、理化指標(biāo)及揮發(fā)性成分進行了監(jiān)測和分析，得出發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化規(guī)律，為其實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化深層發(fā)酵生產(chǎn)以及優(yōu)化產(chǎn)品品質(zhì)提供了技術(shù)參考和理論依據(jù)。

葡萄富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，是世界上栽培面積最大、產(chǎn)量第二的水果，但其季節(jié)性較強、貯存期較短，采后需及時進行深加工。因此，本研究以葡萄為原料，采用依次接種酵母菌、醋酸菌及乳酸菌的接種發(fā)酵技術(shù)，分析發(fā)酵過程中總酸、有機酸、乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酚、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及-葡萄糖苷酶活力、揮發(fā)性風(fēng)味成分等的動態(tài)變化規(guī)律，以期為實現(xiàn)葡萄酵素的工業(yè)化生產(chǎn)、綜合性開發(fā)以及品質(zhì)的提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

夏黑葡萄（Summer Black）來自河南省南陽市社旗縣；釀酒酵母XQ-05來自河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095來自北京生物保藏中心。

果膠酶（酶活力500 U/mg） 諾維信有限公司；MRS肉湯（乳酸菌通用培養(yǎng)基，生物試劑） 北京奧博星生物技術(shù)公司；0.45 μm聚偏氟乙烯中空纖維微濾膜天津愛生膜公司；檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸（色譜級） 美國Sigma公司；沒食子酸（分析純）天津科密歐公司；磷酸（色譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚、對硝基苯酚（色譜級） 上?？泼軞W公司；福林-酚（分析純） 上海麥克林試劑公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸出粉10 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min（固體培養(yǎng)基再加入1.5%瓊脂粉）。

許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，酵母浸出粉5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1260高效液相色譜儀 美國Agilent儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；AL-04電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-752N紫外-可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市晶玻實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酵素制備

挑選新鮮無損壞的葡萄，洗凈、晾干、打漿后放入已滅菌的玻璃罐中，添加紅糖至糖度為18 °Brix，利用75 mg/mL酶活力500 U/mg的果膠酶于50 ℃酶解40 min，之后100 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫，得到發(fā)酵基質(zhì)，測定其還原糖質(zhì)量濃度（31.91±5.14）g/L，pH 3.77±0.01。

將保藏于甘油管中的3 株菌，分別取20 μL于不同固體培養(yǎng)基中，待長出單菌落后接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基（酵母菌為YEPD培養(yǎng)基、醋酸菌為許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基、乳酸菌為MRS肉湯）中活化，得不同菌株活化液，濃度大于10CFU/mL。以3%（/）接種量將不同菌株活化液接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)制備發(fā)酵菌液，酵母菌于28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)14 h，巴氏醋桿菌于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，植物乳桿菌于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)22 h。

首先，接入發(fā)酵基質(zhì)體積3%酵母菌液，常溫避光發(fā)酵6 d；再接入發(fā)酵基質(zhì)體積5%醋酸菌液，至第27天；采用4 層無菌紗布過濾去渣，而后利用0.45 μm的中空纖維微濾膜過濾除菌；最后接種發(fā)酵基質(zhì)體積的3%乳酸菌液，發(fā)酵至第41天。分別于第0、3、6、13、20、27、34、41天平行取樣3 次。為避免雜菌污染，以上所有操作均在無菌室中進行。

1.3.2 總酸含量的測定

參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》中的方法。

1.3.3 有機酸含量的測定

將2.5 mL樣品與1 mL 10.6%的KFe(CN)·3HO、1 mL 30.0%的ZnSO溶液混合，用去離子水定容至50 mL，反應(yīng)30 min后取上清液離心，再經(jīng)0.45 μm膜和C柱過濾。檢測條件：色譜柱Eclipse XDB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL，流速0.9 mL/min，流動相0.02 mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)pH 2.1），柱溫30 ℃，檢測器二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm。

1.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定

參照陳玉香等的氣相色譜法。

1.3.5 總酚含量的測定

采用福林-酚方法測定。其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)為＝0.001 1-0.001 9，＝0.998 9。

1.3.6 SOD及-葡萄糖苷酶活力的測定

-葡萄糖苷酶活力測定參照侯曉瑞的方法；SOD活力測定參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》中的鄰苯三酚自氧化法。

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味成分測定

將7.5 mL樣品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇添加到20 mL頂空瓶中，置于40 ℃水浴鍋中平衡15 min，將固相微萃取纖維頭插入頂空瓶中萃取吸附40 min后，放入氣相色譜進樣器中解吸6 min。檢測條件：色譜柱為HP-INNOWax毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；烘箱升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min；注射器溫度240 ℃；載氣（氦氣）流量1.45 mL/min，分流比5∶1；離子源和質(zhì)譜傳輸線溫度分別為240 ℃和250 ℃，電子能量為70 eV，質(zhì)量范圍為/33～550。

利用氣相色譜-質(zhì)譜中美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所發(fā)布的NIST14.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合保留時間，對匹配度≥80的香氣物質(zhì)進行定性分析；以已知濃度的3-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法，通過樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味成分與內(nèi)標(biāo)物3-辛醇峰面積比值進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用 ±表示，利用軟件IBM SPSS Statistics 26對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（＜0.05）以及最小顯著差數(shù)法、Duncan多重比較分析，利用軟件Origin 2019繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酵素發(fā)酵過程中總酸及檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸的變化

酵素發(fā)酵中伴隨著各種生物化學(xué)反應(yīng)以及微生物活動等過程，酸類物質(zhì)是該過程中重要的代謝產(chǎn)物，其中總酸度可反映出食用植物酵素的成熟度以及質(zhì)量品質(zhì)，而有機酸則可賦予酵素獨特的風(fēng)味，其不僅是發(fā)酵代謝產(chǎn)物，還可作為發(fā)酵環(huán)境中微生物的碳源和電子供體，其種類和數(shù)量在發(fā)酵過程會發(fā)生變化。由表1、圖1可知，接種酵母菌發(fā)酵期間（0～6 d），總酸含量顯著升高（＜0.05），檸檬酸、蘋果酸、酒石酸含量增多，而乙酸則未檢出。研究發(fā)現(xiàn)葡萄中有機酸主要以檸檬酸、蘋果酸和酒石酸為主，乙酸含量少，幾乎檢測不出。因此表明該階段主要為酵母菌的發(fā)酵作用將葡萄基質(zhì)中的有機酸進一步溶出并且通過糖代謝積累代謝產(chǎn)物。接種醋酸菌后（6～27 d），由于醋酸菌適應(yīng)基質(zhì)較為緩慢，發(fā)酵前7 d總酸含量變化不顯著（＞0.05），而后發(fā)酵13～27 d含量急劇升高，這是因為醋酸菌適應(yīng)基質(zhì)后將酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，大幅提高了總酸含量（圖1）。但該階段乳酸含量逐漸降低，Elferink等研究發(fā)現(xiàn)乳酸含量降低與乙酸的積累相關(guān)，因此，這可能與葡萄酵素發(fā)酵過程中乙酸積累有關(guān)。接種乳酸菌后（27～41 d），總酸含量繼續(xù)升高并于34 d達(dá)到最大值，而后略微降低。陳小偉等在探究草莓酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化時，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前75 d總酸含量不斷增加至78.98 mg/mL，而后略微降低，這主要是由于總酸的累積，影響了發(fā)酵菌株的繁殖與代謝，而且后期主要是接種乳酸菌發(fā)酵，故多元酸的持續(xù)降解會導(dǎo)致酸度略微下降，并且發(fā)酵后期，基質(zhì)中糖類含量減少，有機酸也可能作為微生物的替代碳源而被消耗。乳酸、檸檬酸質(zhì)量濃度在乳酸菌發(fā)酵期間（27～41 d）逐漸增加至最大值102.09 mg/L和67.70 mg/L，而蘋果酸減少至0，這可能是因為乳酸菌通過三羧酸循環(huán)、蘋果酸發(fā)酵等途徑，將蘋果酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸、乳酸等所致。在葡萄酵素接種發(fā)酵的3 個階段中，醋酸菌發(fā)酵階段（6～27 d）對總酸和有機酸含量的增加貢獻(xiàn)最大，并且該階段主要產(chǎn)生醋酸，其發(fā)酵結(jié)束時醋酸質(zhì)量濃度達(dá)到（3 127.80±2.36）mg/L。研究表明，發(fā)酵中產(chǎn)生適量的醋酸可提高酵素產(chǎn)品的營養(yǎng)及風(fēng)味，還可抑制腐敗微生物生長，但當(dāng)酸度過高時，則會對酵素產(chǎn)品的風(fēng)味造成負(fù)面影響。何翠嬋在研究微生物對青梅汁酸度的降低作用時發(fā)現(xiàn)，利用植物乳桿菌能夠?qū)崿F(xiàn)有效降酸，并且發(fā)酵后期由于基質(zhì)糖濃度的降低，有機酸也可被微生物作為替代碳源利用，這與本研究在接種乳酸菌發(fā)酵后期，總酸以及有機酸含量有所降低一致。因此，在接種乳酸菌發(fā)酵（27～41 d）期間，其不僅可以起到提高產(chǎn)品營養(yǎng)成分和功能的作用，還可改善酵素風(fēng)味，使得產(chǎn)品更加柔和協(xié)調(diào)。

表1 葡萄酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化Table 1 Changes of total acid content during fermentation of grape Jiaosu

圖1 葡萄酵素發(fā)酵過程中檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸含量的變化Fig. 1 Changes of citric acid, lactic acid, acetic acid, malic acid,tartaric acid contents during fermentation of grape Jiaosu

2.2 葡萄酵素發(fā)酵過程中乙醇含量的變化

酵母菌在發(fā)酵葡萄酵素過程中，會發(fā)生糖代謝生成乙醇等代謝產(chǎn)物，其含量會影響產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)量，是食用植物酵素的基本理化指標(biāo)。由表2可知，在接種酵母菌（0～6 d）發(fā)酵過程中，乙醇含量顯著增加（＜0.05）；而后接種醋酸菌（6～27 d）發(fā)酵時并未除去酵母菌，這主要是因為研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌啟動發(fā)酵以及適應(yīng)基質(zhì)環(huán)境較為緩慢，而酵母菌與醋酸菌具有互利共生的關(guān)系，當(dāng)與酵母菌共生發(fā)酵時有促進其生長的作用。同時，這也是導(dǎo)致接種醋酸菌發(fā)酵（6～27 d）后乙醇含量呈先緩慢降低后急劇下降的原因，發(fā)酵結(jié)束時乙醇體積分?jǐn)?shù)降低至（0.49±0.09）%。接種乳酸菌（27～41 d）發(fā)酵后，乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)降低，隨后逐漸穩(wěn)定于0.47%，無顯著差異（＞0.05）。張巧等探究大果山楂酵素在發(fā)酵過程中乙醇含量的變化時發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前期，由于酵母菌的發(fā)酵作用，產(chǎn)生了大量乙醇，乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)增加，達(dá)到最大值后，在醋酸菌以及發(fā)酵后期發(fā)生的酯化反應(yīng)的作用下，使得乙醇含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定，這與本研究結(jié)果基本一致。

表2 葡萄酵素發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化Table 2 Changes of ethanol content during fermentation of grape Jiaosu

2.3 葡萄酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

葡萄中含有豐富的酚類物質(zhì)，廣泛分布在葡萄的皮、莖、葉子和核中，其具有抗氧化、抗癌及調(diào)節(jié)心血管等作用。由圖2可知，葡萄酵素發(fā)酵過程中，總酚含量總體呈波動上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時總酚質(zhì)量濃度達(dá)到最大值466.00 mg/L，顯著高于其他發(fā)酵時間樣品（＜0.05），相較于葡萄漿汁，總酚含量提高到2.16 倍，因此發(fā)酵過程可顯著提高葡萄酵素的總酚含量。除此之外，已有報道表明其他酵素產(chǎn)品也有此類現(xiàn)象，例如潘梓源等在優(yōu)化的桂圓酵素發(fā)酵工藝下（菌株組合釀酒酵母+醋酸桿菌+植物乳酸桿菌1∶1∶1、接種量10%、發(fā)酵溫度30 ℃、時間36 h），制備的桂圓酵素總酚含量是桂圓水提液的5.05 倍。范昊安等在探究蘋果梨酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化時，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后總酚含量約增長17.52 倍。剛開始未接種的葡萄漿汁中總酚含量較高，是由于在制備發(fā)酵基質(zhì)時未去除果皮與核。發(fā)酵過程中總酚含量的升高，主要有以下兩個方面的原因，其一是發(fā)酵基質(zhì)中高糖以及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸等物質(zhì)產(chǎn)生的高滲透環(huán)境使得葡萄基質(zhì)中的酚類物質(zhì)溶出；其二是發(fā)酵體系中的微生物可使結(jié)合酚類、大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成游離、小分子酚類物質(zhì)，使其含量增加。接種醋酸菌發(fā)酵前期（6～13 d）以及接種乳酸菌發(fā)酵前期（27～34 d）總酚含量有所下降，這主要是由于在發(fā)酵過程中酚類達(dá)到一定濃度時對微生物具有抑制作用，因此發(fā)酵微生物在生長代謝過程中會產(chǎn)生分解酚類的物質(zhì)。以上表明，葡萄酵素發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的變化與原料、發(fā)酵條件以及微生物的作用等有關(guān)。

圖2 葡萄酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig. 2 Changes of total phenol content during fermentation of grape Jiaosu

2.4 葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD以及β-葡萄糖苷酶活力的變化

食用植物酵素在發(fā)酵過程中會代謝生成多種功效酶類，例如蛋白酶、-葡萄糖苷酶以及SOD等，其中SOD常被用來衡量食用植物酵素酶活性的高低，而-葡萄糖苷酶則與食用酵素香氣成分的形成以及酚類物質(zhì)的釋放有關(guān)。因此，分析葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD及-葡萄糖苷酶活力的動態(tài)變化具有重要意義。由圖3所示，葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力整體呈波動升高的趨勢，這主要是因為發(fā)酵過程中基質(zhì)環(huán)境的改變以及微生物生長代謝分泌相應(yīng)的功效酶所導(dǎo)致。接種酵母菌（0～6 d）發(fā)酵以及接種醋酸菌發(fā)酵前中期（6～20 d），SOD活力在22.89～45.00 U/L之間變化且變化不顯著（＞0.05）。隨后接種乳酸菌后，SOD活力繼續(xù)升高至最大值135.00 U/L，符合QB/T 5323—2018中SOD活力≥15 U/L的要求，這表明接種發(fā)酵有利于葡萄酵素SOD的產(chǎn)生。-葡萄糖苷酶活力變化與總酚含量變化趨勢一致，在接種酵母菌（0～6 d）發(fā)酵、接種醋酸菌發(fā)酵中后期（13～27 d）以及接種乳酸菌發(fā)酵后期（34～41 d）其活力逐漸升高，而接種醋酸菌發(fā)酵前期（6～13 d）以及接種乳酸菌發(fā)酵前期（27～34 d）其活力下降，發(fā)酵結(jié)束時酶活力達(dá)到最大值266.57 μU/mL，且顯著高于其他發(fā)酵時間樣品（＜0.05），這與閻欲曉等研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵甘蔗葉過程中，酚類物質(zhì)的釋放與-葡萄糖苷酶活力呈顯著正相關(guān)一致。這表明葡萄酵素發(fā)酵過程中酚類含量的變化與微生物發(fā)酵過程中代謝生成的-葡萄糖苷酶活力等有關(guān)。

圖3 葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD及β-葡萄糖苷酶活力的變化Fig. 3 Changes of SOD and β-glucosidase activity during fermentation of grape Jiaosu

2.5 葡萄酵素發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化

食用酵素在發(fā)酵過程中，不僅能最大程度保留原料本身的香氣成分，而且還可賦予酵素產(chǎn)品新的風(fēng)味，其揮發(fā)性風(fēng)味成分與原料、發(fā)酵方式以及菌種等因素相關(guān)。因此，探究葡萄酵素發(fā)酵期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，對產(chǎn)品精準(zhǔn)制備及品質(zhì)優(yōu)化具有重要意義。由表3、圖4可知，葡萄酵素發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要以醇類、酸類和酯類化合物為主，從葡萄漿汁中共檢測出19 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中酯類6 種、醇類5 種、醛類4 種、醚類2 種、酸類1 種、其他類1 種。發(fā)酵結(jié)束后葡萄酵素中共檢測出21 種香氣成分，其中有9 種香氣成分與葡萄漿汁相同，新產(chǎn)生的12 種香氣成分主要為乙酸異戊酯、乙酸甲酯等酯類，乙酸、丙酸等酸類以及苯乙醇等醇類物質(zhì)。

醇類物質(zhì)主要由發(fā)酵過程中微生物代謝氨基酸、糖類等物質(zhì)產(chǎn)生。由表3、圖4可知，醇類物質(zhì)主要在接種酵母菌（0～6 d）發(fā)酵期間產(chǎn)生，其含量和種類均顯著增加（＜0.05），隨后接種醋酸菌和乳酸菌后，其含量顯著降低（＜0.05），但其種類并未發(fā)生明顯變化。醇類物質(zhì)一方面可賦予葡萄酵素愉悅的風(fēng)味，如少量高級醇使得葡萄酵素具有淡雅的風(fēng)味，另一方面還可以與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，生成葡萄酵素典型的特征性香氣成分酯類物質(zhì)。酯類物質(zhì)具有果香味，其閾值低且氣味活度值較高，故對葡萄酵素的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，在葡萄酵素發(fā)酵后期，長鏈脂肪酸乙酯的生成可以減少葡萄酵素的澀口感，提高其醇厚感。醛類物質(zhì)在發(fā)酵過程中其含量呈先升高后降低的趨勢，且其種類逐漸減少，發(fā)酵結(jié)束時醛類物質(zhì)含量減少至0，這與任婷婷等在探究蘋果漿發(fā)酵過程中醛類物質(zhì)的變化相似。醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，在發(fā)酵過程中可被氧化還原為酸或醇類物質(zhì)。葡萄酵素發(fā)酵過程中特征揮發(fā)性風(fēng)味成分主要以醇類、酸類及酯類物質(zhì)為主，其他香氣成分貢獻(xiàn)較小，因此，在發(fā)酵生產(chǎn)葡萄酵素過程中要合理調(diào)控工藝參數(shù)，使得各類香氣成分達(dá)到最佳水平，并且后續(xù)還需進一步探究并結(jié)合各類非揮發(fā)性成分在發(fā)酵中的變化規(guī)律，從而生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的葡萄酵素產(chǎn)品。

表3 葡萄酵素發(fā)酵過程中各類香氣成分質(zhì)量濃度的變化Table 3 Changes in concentration of each class of aroma components during fermentation of grape Jiaosu μg/mL

圖4 葡萄酵素發(fā)酵過程中各類香氣成分的變化Fig. 4 Changes of number of aroma components during fermentation of grape Jiaosu

3 結(jié) 論

接種發(fā)酵葡萄酵素過程中，不同菌株發(fā)酵階段所代謝生成的有機酸不同，在接種酵母菌（0～6 d）發(fā)酵過程中主要代謝產(chǎn)生檸檬酸、蘋果酸、酒石酸，接種醋酸菌后（6～27 d）主要生成乙酸，而后乳酸菌發(fā)酵階段（27～41 d），主要代謝生成乳酸、檸檬酸；總酸在發(fā)酵過程中呈先升高后略微下降的趨勢，乙醇主要于酵母菌（0～6 d）發(fā)酵期間產(chǎn)生，隨后逐漸降低并趨于穩(wěn)定?？偡雍吭诎l(fā)酵過程中的變化趨勢與-葡萄糖苷酶活力一致，研究發(fā)現(xiàn)其與酚類物質(zhì)的變化具有正相關(guān)性。葡萄酵素發(fā)酵過程中SOD活力總體呈波動上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值135.00 U/L，所生成的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要以醇類、酸類和酯類物質(zhì)為主。通過以上研究明確了葡萄酵素接種發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，可為葡萄酵素的工業(yè)化生產(chǎn)、綜合性開發(fā)以及品質(zhì)的優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。