周貴鳳

（四川民族學(xué)院，四川 康定 626001）

藏豬仔豬腹瀉病是由致病性大腸桿菌引起藏豬仔豬的一種腸道疾病，是危害藏豬仔豬健康的主要常發(fā)性疾病之一，給藏區(qū)養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。慶大霉素、磺胺等藥物是治療本病的常用藥物，但隨著其在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用，越來越多的病原菌產(chǎn)生耐藥性，甚至還引起耐藥性發(fā)生轉(zhuǎn)移；此外，化學(xué)藥物的不規(guī)范使用，可能導(dǎo)致藥物在仔豬體內(nèi)蓄積，造成藥物殘留，影響畜產(chǎn)品安全，危害人類健康。因此，尋找一種對藏豬仔豬腹瀉性大腸桿菌抑菌效果顯著，且不易產(chǎn)生耐藥的藥物具有重要臨床價值和實踐意義。

藏藥因其特殊的生長環(huán)境可能會促使其產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物有可能會成為新藥研發(fā)的先導(dǎo)化合物，再加上藏藥作用靶點(diǎn)多，不易產(chǎn)生耐藥性，有望成為治療動物細(xì)菌性疾病的新型藥物。訶子是最常用的藏藥，在藏藥學(xué)經(jīng)典著作《晶珠本草》里被稱為“藏藥之王”和“治療諸病的上品”。但目前人們對訶子研究不夠深入，還未見有藏藥訶子對藏豬仔豬腹瀉性疾病的相關(guān)報道。

本試驗采用醇提水沉法、水提醇沉法制備藏藥訶子提取物，分別通過索氏提取法和凱氏定氮法測定了訶子提取物中粗脂肪及粗蛋白含量，探究其提取物對藏豬仔豬腹瀉性大腸桿菌抗菌作用的影響，為訶子的開發(fā)和利用提供參考。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品

訶子購買于甘孜藏族自治州藏醫(yī)醫(yī)院。

1.2 試驗菌種

菌種來自于孜州畜科所藏豬保種場中藏豬仔豬腹瀉糞便中分離、鑒定并保存于四川民族學(xué)院農(nóng)學(xué)實驗室中的大腸桿菌。

1.3 試驗藥品

蒸餾水、乙醇、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、各類培養(yǎng)基等。

1.4 主要試驗儀器及器材

凱氏定氮儀（K1100F，山東海能科學(xué)儀器有限公司）；石墨消解儀（SH420，山東海能科學(xué)儀器有限公司）；粗脂肪測定儀（SZF-06B，上海華睿儀器有限公司）；潔超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、pH測試計、恒溫干燥箱、分析天平、電熱套、冷凝管、三頸燒瓶等。

2 試驗方法

2.1 藏藥訶子提取物制備

準(zhǔn)確稱取一定量訶子置于三頸燒瓶內(nèi)，加入沸石與攪拌磁石，加入無水乙醇至沒過藥材且不超過燒瓶2/3處。將藥液浸泡30min，78℃加熱并冷凝回流1h。冷卻、過濾，收集濾液。繼續(xù)向藥渣中加入乙醇，按上述方法再次回流煎煮藥液。將兩次濾液合并后濃縮，按1：3加入蒸餾水，置于4℃冰箱中水沉12h，再過濾，濾液濃縮、定容，使藥濃度為1g/mL。滅菌后保存于冰箱冷藏備用。

除了將煎煮溶劑換為蒸餾水外，操作流程按上述醇提物的方式進(jìn)行，將兩次濾液合并濃縮后按1：3加入無水乙醇，置于4℃冰箱中醇沉12h后再過濾濃縮、定容，使生藥濃度為1g/mL。滅菌后保存于冰箱冷藏備用。

2.2 測定藏藥訶子提取物的pH值

配置鄰苯二甲酸氫鉀及硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，用二點(diǎn)標(biāo)定法對pH計進(jìn)行標(biāo)定后對進(jìn)行樣品進(jìn)行pH值測定。

2.3 藏藥訶子提取物中粗脂肪含量測定

采用索氏提取法測定訶子中粗脂肪含量。稱量剪裁、編號后的濾紙重量，記為m；準(zhǔn)確稱量約1g的樣品，精確到±0.001g，記為m1。用中速濾紙包好樣品（其總重為M1=m1+m2），置于干燥無水棕色瓶，加無水乙醚至完全沒過樣品，密封棕色瓶至過夜（12h左右）。取80mL無水乙醚置于抽提瓶中，放入上述浸泡過夜的濾紙包，用脫脂棉壓住試樣，將抽提瓶連接冷凝管后置于55℃水浴鍋中抽提300min。抽提結(jié)束后，回收乙醚，取出濾紙包，晾干后放入105℃恒溫干燥箱中干燥至恒重后，稱重為M2。粗脂肪重量m=M1-M2=m1+m2-M2，粗脂肪含量=m/m1*100%。

2.4 測定藏藥訶子提取物中粗蛋白質(zhì)含量測定

通過凱氏定氮法測定訶子中蛋白質(zhì)的含量。按說明書提前配制好相關(guān)試劑，做好樣品前處理，清洗管道通路，待數(shù)值穩(wěn)定后，設(shè)置k=0，用空白消化管滴定測出較穩(wěn)定的空白體積，取平均值（V）。在儀器上輸入上述空白體積，設(shè)置k=1，用三只裝有5mL硫酸銨的消化管進(jìn)行滴定，測出滴定體積，根據(jù)空白體積、滴定體積、標(biāo)準(zhǔn)測試液計算出k值，并取平均值。每只消化管里加入待測樣品（樣品重量W），用標(biāo)準(zhǔn)酸進(jìn)行滴定（V），測出蛋白質(zhì)含量。N%=1.401*M（V-V）*k/W

注：M=標(biāo)準(zhǔn)酸摩爾濃度；W=樣品重量（g）；V=空白樣滴定標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量（mL）；V=樣品滴定標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量（mL）；k=定標(biāo)系數(shù)。

2.5 抑菌試驗

將藏豬仔豬腹瀉性大腸桿菌在肉湯培養(yǎng)基中復(fù)活，接種于麥康凱培養(yǎng)基中，挑取典型菌落接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h后，取0.1mL菌液，加入100mL滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中稀釋1000倍，備用。

用試管二倍稀釋法測定藏藥訶子提取物對上述大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）。取96支滅菌試管，將試管分為4大組，每個大組含3小組，1個小組有8支試管，各組內(nèi)連續(xù)編號。每支試管中加入滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2mL。

試驗組：在每組第1管中加入2mL藏藥，按二倍稀釋法稀釋至第6支試管，使前6支試管中的藥物濃度依次為500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5 mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL，再向這6支試管中加入上述稀釋的菌液0.1mL 。

對照組：將每組第7管設(shè)為陽性對照，即不加藏藥提取物，只加等量菌液及肉湯培養(yǎng)基；將第8管為設(shè)陰性對照，即不加菌液，只加等量藥液及肉湯培養(yǎng)基。

結(jié)果判定：將上述試管于37℃的恒溫培養(yǎng)18h后，用接種環(huán)向各個試管中分別取一環(huán)混合液在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上劃線，恒溫培養(yǎng)18h，觀察試驗結(jié)果。如果培養(yǎng)后試管澄清，說明細(xì)菌未生長，該濃度藥液有抑菌作用；如果試管渾濁，則表示細(xì)菌生長，此濃度藥液沒有抑菌效果。以平板上不長細(xì)菌所對應(yīng)的那支試管的最低藥物濃度作為該藥液提取物對該菌的MIC值。

3 試驗結(jié)果

3.1 藏藥訶子提取物的pH值

多數(shù)細(xì)菌的繁殖易受pH 值的影響。通過測定兩種訶子提取物的pH值，其結(jié)果如表1所示：

表1 藏藥訶子提取物的pH值

由表1可知，訶子兩種提取物在常溫下，其pH值均為弱酸性。

3.2 藏藥訶子中粗脂肪含量測定結(jié)果

通過索氏提取法測定訶子的粗脂肪含量，其結(jié)果如表2所示：

表2 藏藥訶子中粗脂肪的含量

由表2可知，訶子的粗脂肪含量為10.0189%。

3.3 藏藥訶子提取物中粗蛋白質(zhì)含量測定

通過凱氏定氮法測定訶子中蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果如表3所示：

表3 藏藥訶子提取物中粗蛋白質(zhì)含量

由表3可知，訶子醇提物中蛋白質(zhì)含量為0.1128%，水提物中蛋白質(zhì)含量為0.0450%。

3.4 藏藥訶子提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）

訶子提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度如表4所示。試驗中陽性對照組中細(xì)菌生長良好，而陰性對照組未見細(xì)菌生長，說明該試驗結(jié)果有效。

表4 藏藥訶子提取物對大腸桿菌的抑菌作用

由表4可知，訶子醇提物對大腸桿菌的MIC為250mg/mL，而訶子水提物對大腸桿菌的MIC則大于500mg/mL，說明訶子醇提物對大腸桿菌的抑菌作用優(yōu)于訶子水提物，對其有輕度抑菌作用。

4 分析與討論

4.1 體外抑菌作用結(jié)果分析

本試驗分別用水提法和醇提法制備了訶子提取物，并測定了其對藏豬仔豬腹瀉性大腸桿菌體外抑制作用。結(jié)果表明，訶子醇提取物對大腸桿菌抑菌效果比水提物的抑菌效果強(qiáng)，可能的原因是水提法只能以水作為溶媒，選擇性較差，只能提取某些無機(jī)鹽、可溶性多糖、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽等物質(zhì)。提取和滅菌過程中溫度較高，可能會破壞熱穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，導(dǎo)致有效成分含量大大減少，從而降低其抑菌效果。乙醇的溶解性好，穿透能力強(qiáng)，不僅能提取水溶性物質(zhì)，還提取某些脂溶性成分，如鞣質(zhì)、酚酸、揮發(fā)油、帖類、蒽醌等成分。而訶子中鞣質(zhì)類等具有抗菌作用的物質(zhì)含量高達(dá) 23.6%～37.36%。由此可見，同種中藥用不同方法制備的提取液對同一菌株會產(chǎn)生不同的抑菌作用。但其抑菌作用相較其對大腸桿菌質(zhì)控菌弱，主要原因可能是該大腸桿菌已出現(xiàn)了一定程度的耐藥性，故其抑菌作用總體來說不顯著。

4.2 pH值測定結(jié)果分析

由表1可知，藏藥訶子提取物的pH 值都偏酸性，其中，訶子醇提物的pH 值比水提物低，再根據(jù)表4結(jié)果推測，中藥的pH值可能會對細(xì)菌的生長產(chǎn)生一定影響。但藥物提取液的pH值對細(xì)菌抑制作用是否具有普遍性或?qū)ζ溆绊懥€需通過大量試驗進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，該試驗數(shù)據(jù)只源于體外抑菌作用的研究，而缺乏其在體內(nèi)作用數(shù)據(jù)。由于中藥進(jìn)入機(jī)體體液、組織液和血液的濃度非常低，且機(jī)體中存在良好的天然緩沖體系，故藥液對機(jī)體 pH 值往往影響較小。因此，后期研究體內(nèi)藥理作用臨床試驗確定中藥的抑菌活性過程中，還需考慮其藥物體內(nèi)對機(jī)體pH變化對試驗結(jié)果的影響。

4.3 粗脂肪提取結(jié)果分析

本課題組試驗研究還發(fā)現(xiàn)訶子中粗脂肪含量（10.02%）比秦皮（8.17%）等藥物的脂肪含量略高，而訶子的抑菌作用比秦皮的抑菌作用好，由此推測粗脂肪含量高的藥物抑菌效果可能較好。這是由于粗脂肪中除脂肪外，還包括脂肪酸、磷脂、糖脂、脂溶性色素及維生素等物質(zhì)。而作為陰離子的表面活性劑的脂肪酸具有一定抗真菌和維持脂肪代謝作用，通過其特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，能快速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并滲透到細(xì)胞中并解離、釋放出H，降低pH值，引起細(xì)菌細(xì)胞代謝障礙和衰竭，造成對酸性敏感的大腸桿菌則被抑制或殺死而起到抗菌的作用。

4.4 蛋白質(zhì)測定結(jié)果分析

通過對訶子提取物中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，表3中顯示訶子醇提物中蛋白質(zhì)含量為0.1128%，水提物中蛋白質(zhì)含量為0.0450%，即訶子醇提物中的蛋白質(zhì)含量比水提物的蛋白質(zhì)含量高，其抑菌作用也相對較高，由此可推測訶子中所含蛋白可能對大腸桿菌具有一定的抑制或殺滅作用，但后期還需通過進(jìn)一步提純試驗進(jìn)行驗證。

5 結(jié)語

本試驗研究了藏藥訶子提取物對藏豬仔豬腹瀉性大腸桿菌的體外抑菌效果。試驗結(jié)果表明，訶子不同提取物對大腸桿菌的抑菌作用不相一致，其中，訶子醇提物對大腸桿菌有輕度敏感，而水提物對大腸桿菌不敏感。此外，還研究了訶子提取物的pH值、粗脂肪及粗蛋白質(zhì)含量與抑菌作用之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者提取物均為中性偏酸性，其中訶子醇提物pH值較低，抗菌作用稍強(qiáng)；而訶子中粗脂肪含量比秦皮等其他藥物含量略高，訶子醇提物中的蛋白質(zhì)含量比水提物的蛋白質(zhì)含量高，其抑菌作用也相對較高。但由于試驗對象偏少，樣本量有限，要得出確切結(jié)論還需進(jìn)一步研究。本試驗研究了藏藥訶子粗提取物的抑菌作用，今后可深入討論藥物中具體成分、含量以其體內(nèi)藥動學(xué)情況；此外，單味藏藥在復(fù)方藥的作用及其配伍禁忌也是今后研究的熱點(diǎn)和方向。