孟磊，張瑩，張旭，龔理，韋信賢，童桂香，高陽

（1浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)動(dòng)物遺傳與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316022；2浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022；3中國科學(xué)院動(dòng)物研究所/動(dòng)物系統(tǒng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；4廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡單，呈母性遺傳，且具有拷貝數(shù)多、進(jìn)化速度快及不同區(qū)域進(jìn)化速率各異等特點(diǎn)，已成為群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)領(lǐng)域研究的重要分子標(biāo)記（Miya et al.，2001；Campbell et al.，2014；Tan et al.，2019）。在線粒體眾多基因片段中，細(xì)胞色素氧化酶I亞基（Cytochrome oxidase subunit I，）具有進(jìn)化速率適中且易于擴(kuò)增的特點(diǎn)，自21世紀(jì)初Tautz等（2002）提出將DNA片段應(yīng)用于物種分類及Hebert等（2003a，2003b）提出DNA條形碼概念以來，線粒體基因受到分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、保護(hù)生物學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)等生物領(lǐng)域的廣泛關(guān)注（吉鵬宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗憲廣等，2013）。因此，建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫對(duì)解決物種鑒定及系統(tǒng)親緣關(guān)系研究等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】吉鵬宇等（2008）基于線粒體基因和16S rRNA部分序列對(duì)福建、東山等6個(gè)擬穴青蟹（）野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同擬穴青蟹野生群體的遺傳背景基本相似，群體間存在著明顯的基因交流。葛家春等（2011）以同樣方法分析中華絨螯蟹（）群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示不同水系中華絨螯蟹群體已不能形成明顯的地理群體結(jié)構(gòu)，即中華絨螯蟹存在明顯的種質(zhì)混雜現(xiàn)象。苗憲廣等（2013）以線粒體基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)鰈形目舌鰨亞科（Cynoglossinae）28種魚類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有舌鰨亞科魚類形成一個(gè)單系群，與無線鰨亞科（Symphurinae）魚類形成穩(wěn)定的姐妹群關(guān)系；此外，遺傳距離結(jié)果支持長吻紅舌鰨（）和紫斑舌鰨（）分別與短吻紅舌鰨（）和短吻三線舌鰨（）是同物異名關(guān)系?？姇韵璧龋?017）利用線粒體基因序列對(duì)泰國近海的69個(gè)有毒水母樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些樣品可以分為13個(gè)種，包括5種缽水母、6種立方水母和2種水螅水母，其中Carukiidae存在新屬新種，進(jìn)一步證實(shí)基因片段能快速有效區(qū)分這些有毒水母種類；類似結(jié)果在Ortman等（2010）、李玉龍等（2017）對(duì)水母物種多樣性及系統(tǒng)發(fā)育研究中也得到驗(yàn)證。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，線粒體基因序列作為物種鑒定的分子條形碼已被廣泛接受；截至2021年1月，國際生命條形碼計(jì)劃（iBOL）數(shù)據(jù)庫中已收錄900萬余條基因序列，而形態(tài)鑒定輔以分子條形碼技術(shù)是解決物種分類鑒定困難的有效途徑之一（杜鶴等，2011；周曉夢(mèng)等，2017；唐富江等，2020；熊娟等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大眼蟹隸屬于十足目（Decapoda）短尾次目（Brachyuran）沙蟹總科（Ocypodoidea）大眼蟹科（Macrophthalmidae），廣泛分布于印度—西太平洋中低潮間帶的泥灘與巖礁地區(qū)，甚至包括亞潮帶區(qū)域（戴愛云等，1986）。早期研究認(rèn)為，大眼蟹隸屬于沙蟹科（Ocypodidae）大眼蟹亞科（Macrophthalminae），但近期的形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果均支持將其提升為科級(jí)水平（毛開云，2010；Chen et al.，2018；Wang et al.，2020）。據(jù)WoRMS（http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=439151&allchildren=1）記載，大眼蟹科包括3亞科13屬131種，當(dāng)前大部分研究聚焦于形態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)習(xí)性等方面（Naderloo，2011，2012），而少有研究關(guān)注該科種類在分子水平上的差異及種間親緣關(guān)系（徐敬明，2009，2010）。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過測(cè)定同屬3種大眼蟹［拉氏大眼蟹（）、日本大眼蟹（）和太平大眼蟹（）］的線粒體基因序列，結(jié)合GenBank已公布的18種大眼蟹科基因部分序列，對(duì)21種大眼蟹的線粒體基因序列進(jìn)行比較分析，探究基因作為大眼蟹科物種鑒定分子標(biāo)記的可行性；同時(shí)基于基因序列構(gòu)建目前最全面的大眼蟹科系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為大眼蟹科系統(tǒng)發(fā)育研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組提取

拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹分別采集于海南陵水海鮮市場(chǎng)、浙江臺(tái)州礁山碼頭和廣東廣州南沙港，每種大眼蟹各取1只。新鮮標(biāo)本以酒精固定后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后用95%酒精保存。分別取蟹類螯足肌肉組織約30 mg，剪碎放入離心管中，采用海洋動(dòng)物基因組織提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量與濃度，并稀釋為50 ng/μL，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

基于短尾次目線粒體基因全序列，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增3種大眼蟹基因全序列的通用引物F1-COI（5'-CYGCCTTATTCATCTAYGC RAGA-3'）/R1-COI（5'-TANACYTCWGGRTGHCCR AARAAYCA-3'）和F2-COI（5'-TCNACAAAYCATAA AGAYATYGG-3'）/R2-COI（5'-TARCGGTTGATHAR GAGT-3'）。PCR反應(yīng)體系44.0μL：Mix酶20.0μL，上、下游引物各2.0μL，DNA模板2.0μL，ddHO補(bǔ)足至44.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，48～54℃50 s，68℃1～3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列拼接、注釋及分析

測(cè)序結(jié)果采用Codoncode Aligner 5.1.5（Codon-Code Corporation，Dedham，MA）進(jìn)行拼接，并輔以手工校對(duì)；利用Sequin v15.10（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/）對(duì)線粒體基因全序列進(jìn)行注釋，運(yùn) 用ClustalX 2.0進(jìn) 行 序 列 比 對(duì)（Larkin et al.，2007），使用MEGA X計(jì)算基因組堿基組成、保守位點(diǎn)和遺傳距離（Kumar et al.，2018），并以MatGAT 2.02進(jìn)行多序列比對(duì)分析（Campanella et al.，2003）。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以三疣梭子蟹（）和紅星梭子蟹（）為外類群，從GenBank下載18種大眼蟹科線粒體基因部分核苷酸序列（表1），結(jié)合本研究測(cè)定的3種大眼蟹基因序列，采用MEGA X中的最大似然法（Maximum likelihood，ML）和最大簡約法（Maximum parsimony，MP）分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Kumar et al.，2018），設(shè)自展值（Bootstrap）為1000次，探究大眼蟹科系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹所用的參考物種信息Table 1 Reference species information for phylogenetic tree

2 結(jié)果與分析

2.1 3種大眼蟹COI基因全序列比較分析結(jié)果

測(cè)序獲得的拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹線粒體基因全序列提交至GenBank，登錄號(hào)分別為MW423579、MW425691和MW425694。三者全長均為1534 bp，編碼511個(gè)氨基酸殘基，均以ATG作為起始密碼子及T作為不完全終止密碼子。3種大眼蟹基因的堿基含量差異不明顯，4種堿基平均組成分別為32.1% T、24.5% C、28.0% A和15.4% G。核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，共有1175個(gè)保守位點(diǎn)及359個(gè)變異位點(diǎn)（約占23.4%），其中絕大多數(shù)變異位點(diǎn)出現(xiàn)在第3位密碼子（313個(gè)變異位點(diǎn)），第1位密碼子存在43個(gè)變異位點(diǎn)，第2位密碼子非常保守，僅有3個(gè)變異位點(diǎn)（圖1-A）；基因整條序列均為連續(xù)編碼，不存在堿基插入或缺失現(xiàn)象。將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列再進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)率為3.1%（圖1-B），說明基因第3位密碼子變異并不一定會(huì)導(dǎo)致氨基酸改變，該現(xiàn)象稱為遺傳密碼的簡并性，即第3位密碼子編碼基因時(shí)具有搖擺性，可保證遺傳密碼決定的氨基酸相對(duì)穩(wěn)定，從而保證遺傳性狀及物種的相對(duì)穩(wěn)定性（Jeacock et al.，2018；Zhou et al.，2018）。

圖1 3種大眼蟹線粒體COI基因核苷酸序列（A）及其推導(dǎo)氨基酸序列（B）比對(duì)分析結(jié)果Fig.1 Alignment of nucleotide sequence（A）and deduced amino acid sequence（B）of mitochondrial COI gene of 3 Macrophthalmus species

2.2 21種大眼蟹COI基因部分序列比較分析結(jié)果

21種大眼蟹基因序列對(duì)應(yīng)的物種信息詳見表1，用于多序列比對(duì)的序列長度為657 bp，連續(xù)編碼219個(gè)氨基酸殘基，不存在堿基插入或缺失現(xiàn)象。21種大眼蟹基因的堿基含量略有區(qū)別：28.9%～35.9% T、18.9%～27.2% C、25.3%～29.7%A及16.6%～19.0% G（表1）。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，共有390個(gè)保守位點(diǎn)及267個(gè)變異位點(diǎn)（約占40.6%），與3種大眼蟹基因全序列比對(duì)結(jié)果一致，絕大多數(shù)變異位點(diǎn)出現(xiàn)在第3位密碼子（213個(gè)變異位點(diǎn)），第2位密碼子非常保守，僅有5個(gè)變異位點(diǎn)，第1位密碼子存在48個(gè)變異位點(diǎn)（圖2）。同樣，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列再進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)減少至20個(gè)，其中還包括10個(gè)自裔位點(diǎn)（Singleton site），變異位點(diǎn)率僅占9.13%（圖3），同樣表現(xiàn)出遺傳密碼的簡并性。

圖2 21種大眼蟹線粒體COI基因核苷酸序列比對(duì)分析結(jié)果Fig.2 Alignment of nucleotide sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

2.3 遺傳距離及相似性分析結(jié)果

圖3 21種大眼蟹線粒體COI基因推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果Fig.3 Deduced amino acid sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

表2 21種大眼蟹科物種線粒體COI基因的遺傳距離（左下角）及序列相似性（右上角）Table 2 Genetic distance（bottom left）and sequence similarity（upper right）of COI gene in 21 Macrophthalmidae species

計(jì)算21種大眼蟹科物種的基因遺傳距離及其序列相似性（表2），結(jié)果顯示攝氏大眼蟹（）與米氏大眼蟹（）間的遺傳距離最?。?.039），二者對(duì)應(yīng)的序列相似性最高（96.2%）；其次為波斯張口蟹（）與大眼蟹科未定種（Macrophthalmidae sp.），二者的遺傳距離為0.067，對(duì)應(yīng)的序列相似性為93.6%。日本大眼蟹（）、太平大眼蟹（）和拉氏大眼蟹（）分別與萬歲大眼蟹（）、絨毛大眼蟹（）和隆背大眼蟹（）存在最小的遺傳距離，分別為0.105、0.179和0.158，對(duì)應(yīng)的序列相似性分別為90.3%、84.3%和86.2%。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

基于線粒體基因序列，以三疣梭子蟹和紅星梭子蟹為外類群，分別以最大似然法和最大簡約法構(gòu)建大眼蟹科的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和支持率上略有區(qū)別（圖4）。在最大似然法和最大簡約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，均表現(xiàn)為日本大眼蟹與萬歲大眼蟹的親緣關(guān)系最近、太平大眼蟹與絨毛大眼蟹的親緣關(guān)系最近，但拉氏大眼蟹的進(jìn)化地位在2種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中存在較大分歧，在最大似然系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與隆背大眼蟹的親緣關(guān)系最近（圖4-A），而在最大簡約系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與隆背大眼蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，獨(dú)立處于一支（圖4-B）。值得注意的是，在2種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中均顯示大眼蟹屬物種并非聚為一支形成單系群。其中，最大似然系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分為三大分支，一支由13種大眼蟹屬物種組成，另一支由3種大眼蟹屬和紅樹泥方蟹（）組成，剩余一支由平背大眼蟹（）單獨(dú)組成（圖4-A）；最大簡約系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹則分為四大分支，其中兩支分別由12種和3種大眼蟹屬物種組成，剩余兩支分別由拉氏大眼蟹和平背大眼蟹單獨(dú)組成（圖4-B）。此外，2種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均顯示薄氏張口蟹（）、波斯張口蟹（）和大眼蟹科未定種聚為一支，具有較高的支持率，故推斷該未定種為張口蟹屬種類。

3 討論

自DNA條形碼的概念被提出以來，該技術(shù)經(jīng)過20年的迅猛發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、保護(hù)生物學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)等生物領(lǐng)域（胡永春等，2020；毛啟迪等，2020），成為不同生物類群物種鑒定、群體遺傳及系統(tǒng)進(jìn)化等研究的重要手段（吉鵬宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗憲廣等，2013）。據(jù)WoRMS記載，蟹類的物種和形態(tài)特征均豐富多樣，目前已有7250種短尾類（Brachyuran）被發(fā)現(xiàn)。早期的蟹類分類主要依靠經(jīng)典的形態(tài)學(xué)方法，但由于形態(tài)學(xué)分類具有一定的主觀性且易受環(huán)境因素干擾，因此在蟹類分類及系統(tǒng)發(fā)育研究中很可能得到不一致的結(jié)論（Ng and Schubart，2003；Naderloo，2011）。如相手蟹科（Sesarmidae）種類形態(tài)十分接近，導(dǎo)致該科物種的鑒定和分類長期處于混亂狀態(tài)（Ng et al.，2019）。Schubart和Ng等（2021）以形態(tài)學(xué)與分子鑒定相結(jié)合的方法，校正了長期混亂的螳臂蟹屬（）和假相手蟹屬（）的分類問題，重新厘定該科的分類系統(tǒng)（新增8個(gè)新屬），并對(duì)GenBank中相關(guān)種類命名提出質(zhì)疑。

大眼蟹科種類豐富，包括3亞科13屬131種，目前鮮見關(guān)于該科種類分子遺傳多樣性及種屬親緣關(guān)系的研究報(bào)道（徐敬明，2009，2010；Wang et al.，2020）。線粒體、和16S rRNA等基因序列具有序列相對(duì)保守、易擴(kuò)增及進(jìn)化速度適中等特點(diǎn)，是目前研究物種分類和科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化的重要分子標(biāo)記（苗憲廣等，2013；王淑英等，2014；徐巖等，2019）；但少數(shù)串聯(lián)基因尤其是單基因由于遺傳信息位點(diǎn)相對(duì)較少，越來越多的研究趨向于依靠線粒體基因組全序列來解決上述難題（Campbell et al.，2014；Lavouéet al.，2014；Zhang et al.，2020）。至今，大眼蟹科僅測(cè)定了4個(gè)物種（日本大眼蟹、短身大眼蟹、太平大眼蟹和達(dá)爾文大眼蟹）的線粒體基因組全序列，故無法有效開展該科系統(tǒng)發(fā)育研究。為此，本研究基于線粒體基因序列分析21種大眼蟹的分子多樣性水平，同時(shí)構(gòu)建目前最全面的大眼蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。通過比對(duì)分析21種大眼蟹基因部分序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)物種均有區(qū)別于其他種類的特異位點(diǎn)，因此可考慮作為物種鑒定的分子標(biāo)記。遺傳距離、序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果均表明，日本大眼蟹與萬歲大眼蟹的親緣關(guān)系最近、太平大眼蟹與絨毛大眼蟹的親緣關(guān)系最近。此外，Gen-Bank中的大眼蟹科未定種與波斯張口蟹的親緣關(guān)系最近，然后與薄氏張口蟹聚類形成張口蟹屬單系群，從而確定該未定種為張口蟹屬種類。

本研究分別以最大似然法和最大簡約法構(gòu)建大眼蟹科的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和支持率上略有區(qū)別，究其原因可能是基因包含的有效信息位點(diǎn)有限（僅657 bp），在解析某些物種間的親緣關(guān)系上仍顯不足。此外，某些屬（如泥方蟹屬）僅涉及一個(gè)物種，也有可能造成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹不穩(wěn)定。即便如此，2種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均顯示大眼蟹屬可能是非單系群，后續(xù)研究應(yīng)基于更多基因序列及更多物種數(shù)來重點(diǎn)闡述這一現(xiàn)象。

圖4 基于線粒體COI基因序列構(gòu)建的大眼蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Macrophthalmidae family phylogenetic tree based on mitochondrial COI gene sequence

4 結(jié)論

21種大眼蟹線粒體基因序列均有區(qū)別于其他種類的特異位點(diǎn)，可考慮作為物種鑒定的分子標(biāo)記；但用于多序列比對(duì)的基因部分序列包含有效信息位點(diǎn)有限，在解析某些物種間的親緣關(guān)系上仍顯不足，部分種類間的親緣關(guān)系可信度較低，因此后續(xù)研究應(yīng)基于更多基因序列及更多物種數(shù)以解決這一問題。