凱氏定氮全定量、半定量法以及杜馬斯燃燒法測定米糠粗蛋白優(yōu)劣勢比較*

李小丹,朱麗瓊，曾彩虹，劉 鑫，吳家乾，李丹青，潘傳榮

（1.廣東湛江國家糧食質(zhì)量監(jiān)測站，廣東 湛江 524045；2.廣東省糧食科學(xué)研究所有限公司，廣州 510050）

米糠是稻谷加工時糙米碾米的主要副產(chǎn)品，其重量占稻谷總重10%左右，主要成分由種皮和胚構(gòu)成[1]，米糠營養(yǎng)豐富，是重要的蛋白資源。為提升米糠的利用價值，在米糠中提取蛋白質(zhì)進行轉(zhuǎn)化利用是多年來的熱門課題，如何快速測定米糠或提取物中粗蛋白含量是科研人員經(jīng)常關(guān)注的問題。

粗蛋白含量測量方式有傳統(tǒng)的凱氏定氮法和當(dāng)前越來流行的杜馬斯儀器燃燒法，其中凱氏定氮法有全定量和半定量方式。1883年丹麥化學(xué)家凱道爾建立了經(jīng)典的“凱氏定氮法”來測量有機物中的總氮，迄今為止被人們應(yīng)用了100多年的時間。更早在1831年，法國化學(xué)家杜馬斯首創(chuàng)一種定氮法，在燃燒管的前端貯有碳酸鉛，在試樣分解前，燃燒時氮的氧化物通過紅熱的銅粉后被還原可得出有機物中的含氮量[2]。杜馬斯定氮法比凱式定氮法足足早了52年，因為機理復(fù)雜和檢測成本高導(dǎo)致了在實際應(yīng)用中受到限制，在熱導(dǎo)檢測器（TCD）技術(shù)成熟應(yīng)用之后，杜馬斯定氮儀才得以普及應(yīng)用。熱導(dǎo)檢測器基于不同氣體具有不同的熱導(dǎo)率，當(dāng)被測組分與載氣一起進入熱導(dǎo)池時，由于混合氣的熱導(dǎo)率的不同，鎢絲傳向池壁的熱量也發(fā)生變化，致使鎢絲溫度發(fā)生改變，其電阻也隨之改變，進而使電橋輸出端產(chǎn)生不平衡電位而作為信號輸出。在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)測定》凱氏定氮法為第一法屬仲裁方法，燃燒法為第三法。

本文依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[3]方法以及在實際工作中的檢測經(jīng)驗，利用凱氏定氮儀中的全定量和半定量法以及杜馬斯燃燒法，分別以全麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與蔗糖配成不同含量粗蛋白標(biāo)準(zhǔn)粉、廣東境內(nèi)絲苗米廠生產(chǎn)的新鮮米糠為檢測對象，對3種方法測量粗蛋白的準(zhǔn)確性、平行性和線性范圍進行測試比較，總結(jié)探討測試人員應(yīng)用各方法時孰優(yōu)孰劣。

1 儀器方法

1.1 杜馬斯燃燒法

氣路和燃燒室溫度等儀器狀態(tài)調(diào)試好后，儀器本身有以EDTA為參照物做的內(nèi)置外標(biāo)法用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用錫箔紙稱粉狀樣品0.0500 g左右，成團揉好放入自動進樣盤，輸入蛋白系數(shù)，自動測量結(jié)果，儀器如圖1所示。

圖1 德國格哈特N-pro杜馬斯定氮儀和自動進樣盤

1.2 半定量凱氏定氮法

稱取粉狀樣品1 g于配套石英U型試管中,加入1:12硫酸銅和硫酸鉀3.2 g和12 mL硫酸,放入消化爐450℃，全部碳化3 h呈綠色透明,取出冷卻，套上定氮蒸餾裝置（圖2）,放入加好3滴溴甲酚綠亞甲基藍混合指示劑的2%硼酸150 mL，注入40%NaOH濃堿使消化管硫酸銅沉淀變黑，水蒸氣蒸餾使硼酸吸收液到250 mL,轉(zhuǎn)到滴定臺手工用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定灰藍色轉(zhuǎn)棕紅色，計算結(jié)果。

圖2 上海纖檢儀器有限公司KDN-2C型半定量凱氏定氮儀和消化爐

1.3 全定量凱氏定氮法

稱取粉狀樣品0.5 g于配套石英U型試管中,加入1:12硫酸銅和硫酸鉀2 g和12 mL硫酸,放入石墨消化爐450℃，全部碳化2 h呈綠色透明,取出冷卻套上全定量蒸餾裝置（圖3）,儀器有配好帶有混合指示劑的2%硼酸，20%NaOH濃堿和0.05 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，全程自動滴定，以光敏元件判斷終定，輸入蛋白系數(shù)，自動計算結(jié)果。

圖3 青島海能KN1100型全定量凱氏定氮儀和消化爐

2 測試對象

2.1 米糠原料

新鮮米糠，梅州建豐糧業(yè)發(fā)展有限公司提供。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100126，證書標(biāo)注粗蛋白含量（15.8±0.3）%、蔗糖和兩者混合物，混合物粗蛋白含量見表1。

表1 全麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和蔗糖混合物

3 實驗結(jié)果

3.1 杜馬斯定氮儀

乙二胺四乙酸（EDTA）是一種相對穩(wěn)定的有機物，其化學(xué)式為C10H16N2O8，含N量為9.59%，依次稱取不同質(zhì)量EDTA（純度大于99.999%）放入燃燒儀測試，記錄峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白系數(shù)米糠取5.95，標(biāo)準(zhǔn)品與混合物取5.7。結(jié)果見表2、表3、圖4和圖5。

表2 EDTA質(zhì)量和峰面積

圖4 杜馬斯定氮儀EDTA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 杜馬斯定氮儀測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

3.2 半定量凱氏定氮法

半定量凱氏定氮法結(jié)果如表4和圖6。

圖6 半定量凱氏定氮法測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

表4 樣品半定量凱氏定氮法測試結(jié)果

3.3 全定量凱氏定氮法

全定量凱氏定氮法結(jié)果如表5和圖7。

圖7 全定量凱氏定氮法測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

表5 樣品全定量凱氏定氮法測試結(jié)果

4 結(jié)果與討論

（1）分別采用杜馬斯燃燒法、半定量凱氏定氮法、全定量凱氏定氮法對全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、蔗糖、兩者混合物和米糠樣品測定，從圖5、6、7的測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性看出，相關(guān)性R2杜馬斯燃燒法0.9929＞R2半定量凱氏定氮法0.9885＞R2全定量凱氏定氮法0.9751；從表3、4、5中可以看出杜馬斯燃燒法與蛋白理論值的偏差分布在-0.4～0.6之間，半定量凱氏定氮法分布在-1.8～0.1之間，全定量凱氏定氮法分布在-1.6～1.1之間。從數(shù)據(jù)看出杜馬斯燃燒法測量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高于凱氏定氮法；凱氏定氮法中的半定量方式優(yōu)于全定量凱氏定氮法。三種定氮測定方法比較如表6：

表3 樣品杜馬斯燃燒法測試結(jié)果

表6 三種定氮方式比較

（2）通過對凱氏定氮法的全定量和半定量法及杜馬斯燃燒法測定蛋白質(zhì)實驗的比較發(fā)現(xiàn)，作為蛋白質(zhì)測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，三種方法檢測結(jié)果并沒有顯著性差異，所以測定米糠中粗蛋白含量時采用三種方法均是可行的。凱氏定氮法所需設(shè)備價格低、成本低廉、已經(jīng)有著廣泛的應(yīng)用，即使在很小的實驗室也可以用簡單的凱氏定氮裝置實現(xiàn)蛋白質(zhì)的測定，但是操作時間長，有一定的危險性，產(chǎn)生有毒有害氣體，危害人體健康，結(jié)果易受人為影響。杜馬斯燃燒法操作過程簡便快捷，時間只需幾分鐘，不需人看管，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，但是儀器很昂貴，檢測成本高。然而，在今天人們越來越注重人員健康和環(huán)境保護，鑒于杜馬斯燃燒法顯而易見的優(yōu)點，在蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域有逐漸增多趨勢。