不同濃度新型分裂素PBU誘導(dǎo)的尾巨桉愈傷組織中miRNA396及CKX基因表達(dá)差異研究

劉亞梅 吳宇朋 李莉梅 蘇 敏 余 珠 歐陽(yáng)樂(lè)軍*

（1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，喀什 844000；2. 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，茂名 525000）

桉樹(shù)是世界上公認(rèn)的三大人工林樹(shù)種之一，在全球各地的種類(lèi)已達(dá)到1 000多種。桉樹(shù)不僅在環(huán)境綠化、生態(tài)保護(hù)等方面起著重要作用，還廣泛應(yīng)用于制漿造紙行業(yè)，也可作為實(shí)木用材，葉片還可用于提煉桉葉油，在化工生產(chǎn)方面也有著重要作用。中國(guó)是目前世界上種植桉樹(shù)面積第三的國(guó)家，其木材產(chǎn)量占全國(guó)木材總產(chǎn)量的30%左右，大大緩解了我國(guó)對(duì)天然林保護(hù)的壓力。尾巨桉（）是尾葉桉和巨桉的雜交種，具有良好的雜交優(yōu)勢(shì)，是綜合性比其他桉樹(shù)品種更好的速生樹(shù)種。因桉樹(shù)種子高度雜合，其種苗生產(chǎn)一直是通過(guò)植物組培技術(shù)進(jìn)行，但普遍存在不定芽分化效率不理想，再生效率低等問(wèn)題。由于桉樹(shù)的遺傳背景較為復(fù)雜，遺傳機(jī)理尚未明確，大多數(shù)性狀屬于多基因調(diào)控，常規(guī)育種手段已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足培育不同用途的桉樹(shù)優(yōu)良品種的需求，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳改良具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

建立尾巨桉高效的離體再生體系是開(kāi)展基因工程育種的前提，因此，尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化機(jī)理的研究受到廣大研究工作者的高度重視。尾巨桉離體再生過(guò)程受到多方面因素的影響，其中內(nèi)源激素的調(diào)控尤為重要，如細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素等。尾巨桉愈傷組織的內(nèi)源激素受miRNA所調(diào)控，miRNA396便是其中一種與尾巨桉愈傷組織內(nèi)源分裂素含量緊密相關(guān)的miRNA，從而調(diào)控愈傷組織的分化與不定芽的發(fā)生。最近幾年關(guān)于miRNA396基因家族的研究表明，在擬南芥中的miRNA396 有miRNA396A 和miRNA396B兩個(gè)基因，靶向7 個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（Growth-Regulating Factor，），根據(jù)miRBase 上登錄的miRNA396 及其基因家族的研究進(jìn)展來(lái)看，miRNA396是一條相當(dāng)保守的miRNA，僅存在于36 個(gè)物種之中。在 水 稻 中，miRNA396 由8 個(gè) 基 因 編 碼（miRNA396A～H），可以影響水稻的籽粒發(fā)育與抗旱能力等。大豆根系能否正常發(fā)育已被證實(shí)與9 個(gè)miRNA396 及其23 個(gè)靶基因（）所構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有重要關(guān)系。根據(jù)公布的巨桉基因組比對(duì)分析，尾巨桉中miRNA396 家族有miRNA396A、miRNA396B，負(fù)責(zé)調(diào)控尾巨桉愈傷組織中的細(xì)胞分裂素氧化酶基因（Cytokinin oxidase gene，）與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因，從而參與尾巨桉愈傷組織內(nèi)源激素對(duì)其生長(zhǎng)分化的調(diào)控。細(xì)胞分裂素幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的全部過(guò)程，特別是細(xì)胞的分裂與分化的過(guò)程，而基因可以有效地調(diào)節(jié)植物組織中細(xì)胞分裂素的水平，進(jìn)而參與了調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。據(jù)研究，miRNA396通過(guò)調(diào)控其靶基因來(lái)影響植物的生根、發(fā)芽、開(kāi)花和結(jié)果等生物學(xué)過(guò)程，也能控制植物體內(nèi)細(xì)胞的代謝與植物對(duì)脅迫的反應(yīng)。歐陽(yáng)樂(lè)軍等前期研究中發(fā)現(xiàn)新型分裂素PBU 對(duì)尾巨桉再生具有重要的調(diào)控作用。因此，研究不同濃度的PBU 處理下，尾巨桉愈傷組織miRNA396及基因表達(dá)差異，對(duì)研究尾巨桉高效再生體系建立有重要意義。

本研究以尾巨桉的無(wú)性系無(wú)菌苗的莖段作為外植體，以MS 作為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂、蔗糖，并用自主合成的高活性噻唑基脲類(lèi)新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑PBU（專(zhuān)利號(hào)：ZL200510035860.X）結(jié)合IAA 誘導(dǎo)愈傷組織，選取不同濃度PBU 處理的桉樹(shù)愈傷組織樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析了基因家族和miRNA396A、miRNA396B 在尾巨桉不同愈傷組織中的表達(dá)差異，初步分析miRNA396和基因?qū)ξ簿掼駜?nèi)源激素的調(diào)控作用。本研究結(jié)果可為優(yōu)化尾巨桉胚性愈傷組織誘導(dǎo)提供一定依據(jù)，為揭示尾巨桉胚性愈傷組織發(fā)生及分化的分子機(jī)制提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湛江市林業(yè)科學(xué)研究所提供的尾巨桉無(wú)菌苗為材料，切取無(wú)芽點(diǎn)的莖段分別接種在0.5（樣品1）、1.0（樣品2）、2.0（樣品3）mg·L不同質(zhì)量濃度的PBU 誘導(dǎo)愈傷組織，其他培養(yǎng)基組成為MS+0.05 mg·LIAA+100 mg·LVc，pH5.8～6.0，暗 培養(yǎng)2周后光培養(yǎng)1周，分別命名為樣品1、2、3，作為后續(xù)試驗(yàn)材料。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

異丙醇、Tris、EDTA、NaCl、SDS、焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）、無(wú)水乙醇、氯仿、Ms基鹽、蔗糖、瓊脂、Vc等購(gòu)置于廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，新型噻唑基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素（N-phenyl-·N′-［6-（2-chlorobenzothiazol）-yl］urea，PBU）由本實(shí)驗(yàn)室保存，Trans Zol Up Plus RNA Kit總RNA提取試劑盒、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、Perfect StartGreen熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司，TIANgel Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)鑒定及熒光定量PCR引物。以基因作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。引物合成由生工生物工程（廣州）有限公司完成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence used in the expriment

1.4 試驗(yàn)方法

分 別 用Eu396A-F、Eu396B-F 和Eu396A-R、Eu396B-R 為上下游引物，以尾巨桉基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸3 min；4 ℃保存。將得到的PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖（1.5%）凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證并回收目的條帶。

將回收純化所得的PCR 產(chǎn)物送檢測(cè)序，利用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和miRNA396A、miRNA396B 進(jìn)行比對(duì)，用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。引物設(shè)計(jì)方法同1.3，引物合成序列見(jiàn)表1。

分別提取前述3 種不同試驗(yàn)處理得到的愈傷組織RNA，提取方法參照全式金生物技術(shù)有限公司Trans Zol Up Plus RNA Kit 總RNA 提取試劑盒，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。

使用全式金生物技術(shù)公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，將上述RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)操作。

選用樣品1 的cDNA 作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。為研究?jī)?nèi)參基因與目的基因引物特異性，進(jìn)行不同退火溫度梯度的定量PCR 實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置為56、58、60 ℃，其他條件不變。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：2×TransScript Tip Green 熒光定量PCR SuperMix 10.0 μL，正向、反向引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddHO 7.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃30 s，94 ℃5 s，56 ℃/58 ℃/60 ℃15 s，72 ℃10 s，每個(gè)擴(kuò)增40次循環(huán)，每一個(gè)溫度做3個(gè)重復(fù)。

采用全式金生物技術(shù)公司Perfect StartGreen 熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒，StepOne 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對(duì)尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 和基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)參基因選用尾巨桉基因，采用三步法進(jìn)行熒光定量PCR，分析在不同濃度PBU 誘導(dǎo)下得到的桉樹(shù)愈傷組織中miRNA396 和基因的表達(dá)差異。數(shù)據(jù)使用2法計(jì)算分析。熒光定量PCR 的程序設(shè)置為94 ℃30 s，94 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)。使用模板量為1 000 ng 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為熒光定量PCR 的模板，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系同1.4.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA396的PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1 可見(jiàn)，miRNA396A 與miRNA396B 擴(kuò)增條帶很亮，說(shuō)明擴(kuò)增效率好，且兩條目的條帶的大小與預(yù)期相符；條帶濃度好，經(jīng)送樣測(cè)序分析，結(jié)果比對(duì)見(jiàn)圖2，與預(yù)期生信分析的尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 序列完全一致，圖中個(gè)別堿基差異是由套峰所致。

圖1 miRNA396A與miRNA396B擴(kuò)增電泳圖1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396BFig.1 Amplification electrophoresis of miRNA396A gene and miRNA396B gene 1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396B

圖2 miRNA396A與miRNA396B序列比對(duì)圖A.miRNA396A序列比對(duì)圖；B.miRNA396B序列比對(duì)圖Fig.2 Sequencing results of miRNA396A and miRNA396BA.miRNA396A sequence alignment diagram；B.miRNA396B sequence alignment diagram

在DNAMAN 軟件中對(duì)比測(cè)序結(jié)果，選取miRNA396A 和miRNA396B 中一段連續(xù)200 bp 的堿基序列，以此序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物。

2.2 尾巨桉RNA提取結(jié)果

圖3 為不同濃度細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果，不同濃度PBU 誘導(dǎo)得到的愈傷組織在形態(tài)大小上都表現(xiàn)出較大差異。在0.5 mg·L細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織質(zhì)地緊密，呈顆粒狀，在1mg·LPBU 誘導(dǎo)的桉樹(shù)愈傷組織質(zhì)地疏松、較膨大，頂端呈黃白色，在2 mg·LPBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織分裂呈規(guī)則分裂的形態(tài)，整體表現(xiàn)為綠色。

圖3 不同濃度PBU誘導(dǎo)得到的桉樹(shù)愈傷組織A.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBUFig.3 Eucalyptus callus induced by different concentrations of PBUA.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBU

圖4 為不同濃度細(xì)胞分裂素PBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織的RNA 提取電泳結(jié)果?？梢钥闯? 個(gè)樣品RNA 電泳圖中18 與28 S 兩條帶清晰無(wú)降解，并且28 S 的亮度很亮，幾乎是18 S 的兩倍，說(shuō)明提取的RNA 完整性較好。也沒(méi)有雜帶，說(shuō)明RNA 提取過(guò)程中沒(méi)有受到DNA的污染。符合后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。

圖4 不同樣品的RNA提取結(jié)果M.Marker；1～3.樣品1～3Fig.4 RNA extraction results of samplesM.Marker；1-3.Sample 1-3

使用超微量分光光度計(jì)所測(cè)得的RNA 濃度與OD/OD的值。3 份樣品的濃度最低為206 ng·μL，最 高 為655 ng·μL，OD/OD值 都 在1.8～2.0，證明提取的RNA 污染較少，提取的RNA濃度和純度均滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.3 擴(kuò)增特異性分析

為了探究基因及目標(biāo)基因的最適退火溫度，本實(shí)驗(yàn)選用56、58 和60 ℃進(jìn)行熒光定量PCR，對(duì)3 個(gè)溫度的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行分析?，F(xiàn)不同退火溫度下的目標(biāo)基因都呈現(xiàn)單峰，說(shuō)明引物特異性較好，但是基因的熔解曲線(xiàn)在56 與60 ℃時(shí)均出現(xiàn)了雜峰，因此，后續(xù)基因表達(dá)分析采用58 ℃為退火溫度。

2.4 基因表達(dá)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)StepOne Software v2.3軟件分析miRNA 396的表達(dá)差異，根據(jù)所測(cè)得的樣品CT值，代入2法的公式計(jì)算它們的相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS軟件對(duì)基因表達(dá)差異結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析（檢驗(yàn)），其結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織中目標(biāo)基因表達(dá)差異*表示不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織基因表達(dá)量差異顯著；**表示不同濃度PBU誘導(dǎo)的愈傷組織基因表達(dá)量差異極顯著Fig.5 Different expression of target genes in callus induced by different concentrations of PBU* indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.05）；** indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.01）

與樣1 相比較，miRNA396A 和miRNA396B 在樣2 中表達(dá)量均下調(diào)，分別為樣1 的0.003 4 和0.032 1 倍，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果sig=0.000 3＜0.01 和sig=0.004 3＜0.01，說(shuō)明差異極顯著。而樣3 的miRNA396A表達(dá)量下調(diào)為樣1的0.326 4倍，sig=1.46×10＜0.01，差異達(dá)到極顯著水平，miRNA396B表達(dá)量卻上調(diào)為樣1的1.149 3倍，sig=0.050 6＞0.05，差異不顯著。3 個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)都呈現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，且每個(gè)樣品的3個(gè)重復(fù)性較好。

用同樣方法對(duì)基因進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)圖5。與樣1 桉樹(shù)愈傷組織基因表達(dá)量相比較，樣2 的、和基因表達(dá)量下調(diào)，分別為樣1 的0.169 7、0.168 8 和0.756 6 倍，sig=1.067 1×10、sig=0.006 3、sig=0.003 4，均小于0.01，證明差異均達(dá)到極顯著水平，其他基因均上調(diào)。在上調(diào)的基因里，除基因表達(dá)量為樣1的14.360 1倍，sig=0.000 3＜0.01，差異達(dá)到極顯著性水平外，其他兩個(gè)基因表達(dá)差異均不顯著。同樣對(duì)樣3 的基因表達(dá)量進(jìn)行分析。相較于樣1，樣3 的基因均上調(diào)，基因均下調(diào)，上調(diào)基因倍數(shù)對(duì)應(yīng)為樣品1 的1.161 8、4.316 4、14.562 0 倍，顯著性檢 驗(yàn) 結(jié)果sig=0.036 1、sig=0.002 3、sig=0.000 3，差異分別達(dá)到顯著、極顯著和極顯著水平，下調(diào)基因倍數(shù)對(duì)應(yīng)為樣品1 的0.129 2、0.224 3和0.907 6 倍，sig=7.184 1E-09、sig=0.001 0、sig=0.000 4，均小于0.01，差異均達(dá)到極顯著水平。

3 討論

本 研 究 發(fā) 現(xiàn)，miRNA396A 與miRNA396B 在0.5 mg·LPBU 誘導(dǎo)下的桉樹(shù)愈傷組織表達(dá)量最高，因?yàn)樵诘蜐舛确秶鷥?nèi)，隨著細(xì)胞分裂素濃度升高，愈傷組織的生長(zhǎng)代謝加快，在1.0 和2.0 mg·LPBU 處理下的桉樹(shù)愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育狀況要好于用0.5 mg·LPBU 誘導(dǎo)的桉樹(shù)愈傷組織。miRNA396通過(guò)作用其靶基因來(lái)形成調(diào)控植物組織生產(chǎn)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在本研究中的3種樣品中，2.0 mg·LPBU誘導(dǎo)的愈傷組織已出現(xiàn)芽點(diǎn)，生長(zhǎng)狀態(tài)最好。在生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)更好的愈傷組織中，2 個(gè)基因的表達(dá)量都出現(xiàn)了下調(diào)，說(shuō)明miRNA396A 與miRNA396B 負(fù)調(diào)控尾巨桉愈傷組織內(nèi)源激素合成。細(xì)胞分裂素在高等植物中存在主要部位是細(xì)胞分裂活躍的器官和組織，CKX 是目前已知惟一的專(zhuān)一催化天然異戊烯類(lèi)CK 及其核苷的不可逆降解的黃素酶，它的合成由基因表達(dá)調(diào)控。通過(guò)降解細(xì)胞分裂素，調(diào)控植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素平衡，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)與植物的抗逆性和產(chǎn)量有密切的聯(lián)系?；蚝突蛟?.0 mg·LPBU 誘導(dǎo)下的桉樹(shù)愈傷組織表達(dá)量最高，因?yàn)榧?xì)胞分裂素氧化酶通過(guò)氧化細(xì)胞分裂素從而下調(diào)植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞分裂素含量，由于環(huán)境中的細(xì)胞分裂素濃度大大增加，為了使愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞分裂素水平達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，降解掉多余的CK，和基因在轉(zhuǎn)錄成mRNA 時(shí)受到正向調(diào)控，促進(jìn)了它們的表達(dá)。同時(shí)細(xì)胞分裂素的含量是促進(jìn)愈傷組織芽分化的重要因素之一，樣品3 的愈傷組織和樣品1、2 在外觀(guān)上已有明顯區(qū)別，樣品1、2 的愈傷組織整體呈紅色，而樣品3的愈傷組織呈大面積綠色，已經(jīng)有分化出芽點(diǎn)的趨勢(shì)，可見(jiàn)在小于2 mg·LPBU 濃度時(shí)，升高培養(yǎng)基中的PBU 濃度可促進(jìn)芽的分化。

本研究通過(guò)探究miRNA396 在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期及在不同濃度細(xì)胞分裂素培養(yǎng)的尾巨桉愈傷組織表達(dá)效率差異，初步確立了miRNA396 在尾巨桉植物組織中的調(diào)控情況和基因的表達(dá)差異，為后續(xù)進(jìn)行尾巨桉miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析奠定了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)，可繼續(xù)進(jìn)行基因的表達(dá)效率差異測(cè)定的研究，從而確立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系對(duì)尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的具體調(diào)控方法，進(jìn)一步促進(jìn)新型分裂素PBU 在尾巨桉高活性愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化中的應(yīng)用?；蚓哂械慕M織表達(dá)特異性，即使是在同一個(gè)進(jìn)化分支上的基因表達(dá)模式也不盡相同，因此可以推測(cè)基因在進(jìn)化過(guò)程中分化出了不同的功能?；蚣易宓牟煌蓡T在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段都在相應(yīng)的組織部位中發(fā)揮著其特定的作用，但其具體作用還有待深入探究。miRNA396 在植物中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，研究miRNA396 及其靶基因?qū)χ参锝M織生理分化等的影響具有重要意義。miRNA396 基因家族在多種植物中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)正逐漸被解密，在尾巨桉中的表達(dá)與調(diào)控只是miRNA396 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中極小的一部分。相信在未來(lái)，miRNA 在植物發(fā)育中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)究會(huì)成為眾多研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。