白向東 顧宸瑞 張瀟月 姜 靜

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

Golden2-like（GLK）轉(zhuǎn)錄因子，是一類(lèi)植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，屬于MYB 轉(zhuǎn)錄因子大家族中的GARP 轉(zhuǎn)錄因子超家族。該基因主要調(diào)控植物的葉綠體發(fā)育、影響果實(shí)品質(zhì)，同時(shí)也參與植物生物脅迫和非生物脅迫、植物衰老和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。研究表明，GLK 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)影響質(zhì)體—核逆行信號(hào)進(jìn)而調(diào)控植物葉綠體的代謝和發(fā)育。對(duì)水稻（）、苔蘚（）和擬南芥（）的研究發(fā)現(xiàn)，突變體表現(xiàn)出淺綠色的葉片，并且葉綠素合成的前體物質(zhì)積累變少。在擬南芥突變體中過(guò)量表達(dá)基因則葉色能夠恢復(fù)正常綠色。AtrGLK 蛋白通過(guò)特異結(jié)合到一些天線蛋白和葉綠素合成酶相關(guān)基因啟動(dòng)子上，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。張嫚嫚等研究證明，白樺缺失突變株的葉片呈現(xiàn)黃色，進(jìn)而從白樺中分離該基因，遺傳轉(zhuǎn)化白樺顯示，白樺突變株導(dǎo)入后其葉色恢復(fù)為綠色，而白樺干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的葉色為鮮艷的黃綠色，表達(dá)量、葉片葉綠素含量均顯著低于野生型白樺，獲得的7 個(gè)干擾表達(dá)植株，其株高生長(zhǎng)與野生型白樺差異不顯著。同樣，銀中楊（）基因干擾表達(dá)株系同樣其葉片的基因表達(dá)量顯著降低，光合色素含量均顯著低于野生型銀中楊，葉色為鮮艷黃綠色?；谏鲜觯珿LK 轉(zhuǎn)錄因子是開(kāi)展分子設(shè)計(jì)育種改良葉色的首選基因。

歐洲白榆（）為榆科（Ulmaceae）榆屬（）落葉喬木，原分布于歐洲各地，近年來(lái)被廣泛引種到我國(guó)北方地區(qū)栽植，生長(zhǎng)較快、木材堅(jiān)硬可作為農(nóng)具、建筑和家具用材，翅果可榨油，枝、葉、樹(shù)皮內(nèi)含單寧，味澀苦，很少受到牲畜危害，是牧區(qū)造林的理想樹(shù)種。另外，歐洲白榆的樹(shù)體優(yōu)美、葉片較大，遮陽(yáng)性強(qiáng)，也是城市園林綠化的備選樹(shù)種。因此歐洲白榆具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。若采用分子設(shè)計(jì)育種手段通過(guò)抑制基因的表達(dá)創(chuàng)制金葉白榆，則能提升該樹(shù)種在園林綠化中的作用及應(yīng)用前景。

RNA-seq 的興起和對(duì)于分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有極大的促進(jìn)作用，其中mRNA 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)σ恍](méi)有參考基因組物種的基因克隆產(chǎn)生了很大的幫助，本研究利用轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)為參考進(jìn)行基因克隆，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步篩選內(nèi)參基因，分析基因的組織表達(dá)特性，為研究的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

歐洲白榆的種子取自哈爾濱市道里區(qū)金河公園，將種子晾干洗凈后播種在種植土壤中，種植土壤比例V（草炭土）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）為6∶3∶1。每隔2 d澆1次水，待14 d后選取生長(zhǎng)健壯的苗木，采集根、莖和葉，放在液氮中急速冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄

以歐洲白榆的根、莖和葉為材料，使用植物總RNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取RNA，分別利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 10000（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)總RNA的完整性和濃度，得到合格的歐洲白榆總RNA 后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海東洋紡生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 UlGLK基因的克隆

用歐洲白榆mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫(kù)，通過(guò)毛果楊（）的基因序列進(jìn)行本地BLAST，找出歐洲白榆基因的參考序列。設(shè)計(jì)特異性引物將其命名為-F 和-R（見(jiàn)表1），以上述歐洲白榆的cDNA 為模板進(jìn)行基因克隆。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到到基因片段，將符合預(yù)期的條帶用膠回收試劑盒（杭州博日科技有限公司）回收，回收后的條帶與pGEMTeasy Vector 連接，轉(zhuǎn)入DH5大腸感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后測(cè)序。

表1 本研究用引物序列Table 1 The sequences of primers used in this study

1.4 UlGLK基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站上對(duì)基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用BLAST 對(duì)其進(jìn)行同源性比較。通過(guò)MEGA7 對(duì)得到的堿基序列進(jìn)行翻譯獲得氨基酸序列，對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。使用ExPASy 對(duì)得到的氨基酸序列分析其分子質(zhì)量、原子總數(shù)、分子式等指標(biāo)UlGLK 蛋白的親/疏水性和是否含有信號(hào)肽。使用ProtComp 9.0 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，采用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)UlGLK 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Swiss-model 軟件預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 內(nèi)參基因的篩選

用歐洲白榆mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫(kù)，通過(guò)毛果楊的、、基因序列進(jìn)行本地BLAST 找出歐洲白榆、、基因的參考序列。分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。

1.6 UlGLK基因的組織表達(dá)特性

將上述歐洲白榆根、莖和葉的cDNA 稀釋10倍用于qRT-PCR 模板，以為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，進(jìn)行qRT-PCR 分析，PCR 反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 10.0 μL（日本Toyobo 公司）、模板2.5 μL、上游引物和下游引物（10 μmol·L）各0.5 μL、用去離子水補(bǔ)足體積20.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃30 s；94 ℃12 s，54 ℃30 s，72 ℃30s，循環(huán)45 次；80.0 ℃讀板1 s，收集熒光，繪制熔解曲線，溫度由55 ℃開(kāi)始至99 ℃終止。利用DNA Engine Opticon2 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)MJ Research 公司）完成擴(kuò)增過(guò)程。最后得到的數(shù)據(jù)用2計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 UlGLK基因的的克隆

以歐洲白榆葉片的cDNA為模板，利用特異性引物-F 和-R 對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，在1 400 bp處有擴(kuò)增譜帶（見(jiàn)圖1），將譜帶回收與pGEM-Teasy Vector 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送往擎科生物科技有限公司（哈爾濱）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組參考序列比對(duì)長(zhǎng)度一致，均為1 353 bp，沒(méi)有g(shù)ap 區(qū)域，序列相似度為99.26%，對(duì)比分?jǐn)?shù)為6 675.00。

圖1 UlGLK基因片段PCR擴(kuò)增電泳圖譜M.DL2000 DNA Maker ；1.對(duì)照；2.UlGLK基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of UlGLK geneM. DL2000 DNA Maker；1. Control；2. Amplification products ofULGLK gene

2.2 UlGLK序列分析

通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)基因編碼的蛋白發(fā)現(xiàn)，蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量111 144.04、分子式CHNOS、原子總數(shù)14 082、理論等電點(diǎn)5.00、穩(wěn)定系數(shù)42.51、脂肪系數(shù)27.72。蛋白具有GOLDEN2-LIKE 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域。蛋白為親水性蛋白，沒(méi)有信號(hào)肽區(qū)域?yàn)榉寝D(zhuǎn)膜運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄒ?jiàn)圖2）。ProtComp 9.0軟件預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞核。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖所示（見(jiàn)圖3）。

圖2 UlGLK的親/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity and transmembrane structure of UlGLK

圖3 UlGLK的結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Structure analysis of UlGLK

2.3 UlGLK氨基酸序列同源性比較

將歐洲白榆的的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)后發(fā)現(xiàn)歐洲白榆的GLK 蛋白與川桑（）、大麻（）同源性最高，達(dá)到85%以上，與其他物種的GLK氨基酸序列的相似性也都在80%以上，其中和已證明的擬南芥、銀中楊、毛果楊的GLK 氨基酸序列的同源性也很高（見(jiàn)圖4～5），而且氨基酸序列也具有MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的GCTbox保守結(jié)構(gòu)域?；究梢哉f(shuō)明基因在歐洲白榆體內(nèi)的功能與前述物種相似。

圖4 UlGLK序列比對(duì)結(jié)果UlGLK.歐洲白榆；PeGLK.胡楊；PtrGLK.毛果楊；PaGLK.銀中楊；MnGLK1.川桑；CsGLK1大麻；AtrGLK1/2.擬南芥Fig.4 Sequence alignment results of ULGLKUlGLK.Ulmus laevis；PeGLK.Populus euphratica；PtrGLK.Populus trichocarpa；PaGLK.Populus alba×P.berolinensis；MnGLK1.Morus notabilis；Cs-GLK1.Cannabis sativa；AtrGLK1/2.Arabidopsis thaliana

圖5 UlGLK進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree analysis of UlGLK

2.4 RT-PCR分析內(nèi)參基因的篩選

榆屬植物在分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道較少，迄今為止尚無(wú)RT-PCR 內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道。因此，以白榆根、莖和葉組織cDNA 為模板，采用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增、、內(nèi)參基因，2%凝膠電泳（見(jiàn)圖6）?；蛟诟?、莖和葉3種組織中的擴(kuò)增亮度基本一致，且擴(kuò)增強(qiáng)度也高于其他2 種內(nèi)參基因，說(shuō)明基因在根、莖和葉3 種組織中表達(dá)量基本一致，適合用于后續(xù)的RT-PCR分析。

圖6 Ubiquitin、Actin、Tubulin在歐洲白榆半定量中的分析1～3.Ubiquitin 在根、莖、葉中的表達(dá)量；4～6.Actin 在根、莖、葉中的表達(dá)量；7～9.Tubulin在根、莖、葉中的表達(dá)量Fig.6 Analysis of Ubiquitin，Actin and Tubulin in semi quantitative analysis of U.laevis1-3.Expression levels of Ubiquitin in roots，stems and leaves；4-6.Expression levels of Actin in roots，stems and leaves；7-9.Expression levels of Tubulin in roots，stems and leaves

2.5 UlGLK組織表達(dá)特異性的分析

為了研究歐洲白榆基因在轉(zhuǎn)錄水平上的組織表達(dá)特異性，分別選取歐洲白榆的根、莖和葉的cDNA 為模板，以u(píng)biquitin 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果表明歐洲白榆基因在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，是根中的12倍左右，其次是莖，表達(dá)量最低的是根（見(jiàn)圖7）。

圖7 不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量不同小寫(xiě)字母代表不同組織間差異顯著（P＜0.05）Fig.7 Expression of UlGLK in different tissuesDifferent lowercase letters represent significant differences between different tissues（P＜0.05）

3 討論

由于mRNA 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的興起和發(fā)展，使得大多數(shù)沒(méi)有參考基因組植物的基因克隆情況得到了很大地發(fā)展。本試驗(yàn)基于對(duì)歐洲白榆mRNA轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，準(zhǔn)確地克隆出了基因的序列，基因的全長(zhǎng)為1 353 bp，一共編碼450 個(gè) 氨 基 酸。具 有GOLDEN2-LIKE 類(lèi) 轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，同GLK 基因功能已證明的物種的序列具有很高的同源性，另外在葉中的表達(dá)量顯著高于植株的其他組織和器官，這一結(jié)果與前人的研究相同。

RT-PCR 和qRT-PCR 技術(shù)對(duì)于基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量的研究至關(guān)重要，在基因相對(duì)表達(dá)研究中，內(nèi)參基因的選擇十分重要，只有選擇在不同組織、不同部位和不同發(fā)育階段表達(dá)量基本不變的基因作為內(nèi)參基因，才能精準(zhǔn)確定目的基因的表達(dá)變化。榆科榆屬植物在我國(guó)分布很廣，具有重要的利用價(jià)值，但是在分子生物學(xué)領(lǐng)域研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)歐洲白榆的內(nèi)參基因進(jìn)行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)ubiquitin 基因在根、莖和葉3 種組織中表達(dá)量基本一致，且相較于其他內(nèi)參基因表達(dá)量高，研究結(jié)果，為后續(xù)榆樹(shù)的基因表達(dá)研究提供指導(dǎo)。

GLK 轉(zhuǎn)錄因子屬于GARP 轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，該基因在原始的開(kāi)花植物中是單個(gè)基因，后來(lái)在某些物種中基因進(jìn)行了復(fù)制，通過(guò)一對(duì)基因共同來(lái)調(diào)控葉綠體的發(fā)育，在歐洲白榆轉(zhuǎn)錄組中僅發(fā)現(xiàn)一條GLK 基因。通過(guò)上述研究可以為歐洲白榆的分子育種及榆屬植物基因克隆的研究奠定良好的基礎(chǔ)。