近六年中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果與分析

李玉立,牛振東,劉文杰,井良義,郝運(yùn)偉,張光華

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院（北京市疫苗檢驗(yàn)中心）國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206）

藥品微生物限度檢查于1972年在國(guó)內(nèi)起步，衛(wèi)生部1978年頒布了首個(gè)藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，1995年版《中國(guó)藥典》首次收載了微生物限度檢查法，2000年版《中國(guó)藥典》首次收載了微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，2005年版《中國(guó)藥典》強(qiáng)調(diào)了藥品微生物檢驗(yàn)中的“方法驗(yàn)證”，以避免因方法不合理而造成漏判、誤判[1]。2015年版《中國(guó)藥典》微生物標(biāo)準(zhǔn)體系實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌，較好地解決了與ICH協(xié)調(diào)案標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)問題，且在推動(dòng)藥品微生物控制由“終產(chǎn)品檢驗(yàn)向過程控制方向轉(zhuǎn)變”方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[2]。

中成藥在我國(guó)應(yīng)用廣泛，其主要采用中藥材與中藥飲片進(jìn)行生產(chǎn)。2015年版《中國(guó)藥典》收錄了中藥飲片品種理化性質(zhì)分析的多種鑒別和檢查方法，但相關(guān)微生物的具體檢查方法和限度標(biāo)準(zhǔn)卻長(zhǎng)期處于缺失狀態(tài)。2020年版《中國(guó)藥典》[3]制劑通則要求，各種劑型的中成藥的微生物限度均按照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）與“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”（通則1106）進(jìn)行檢查，同時(shí)2020年版《中國(guó)藥典》（四部）增加了“中藥飲片微生物限度檢查法”（通則1108），但相關(guān)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)還不完善，而且對(duì)煎煮類中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)亦未作出統(tǒng)一、明確的規(guī)定[4]。

本文首先對(duì)近六年北京市藥品檢驗(yàn)研究院承擔(dān)的中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)藥品的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗(yàn)證和匯總，為以后的中成藥國(guó)抽品種方法學(xué)適用性，甚至于該品種收入檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。同時(shí)，文中主要對(duì)所有品種微生物限度檢查結(jié)果進(jìn)行了匯總分析，在評(píng)價(jià)中成藥衛(wèi)生學(xué)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，對(duì)中藥飲片的微生物限度控制與其原料、生產(chǎn)工藝的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，探討了不同工藝所對(duì)應(yīng)的微生物限度風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的不同，同時(shí)提及生產(chǎn)過程中可能存在的一些非傳統(tǒng)工藝，例如射線輻照滅菌，為中成藥微生物控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的完善及重點(diǎn)監(jiān)管品種類型提供參考。

1 儀器、樣品、菌株與培養(yǎng)基

1.1 儀器 LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒）；電熱脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華XG1.DMXD-0.36）；生物安全柜（熱電1300SERIESA2）；PL2002電子天平（梅特勒）；Max Q 6000恒溫?fù)u床（Thermo）。

1.2 樣品 磁朱丸、板藍(lán)根片、小金膠囊、小金丸、小金片、紅金消結(jié)膠囊、紅金消結(jié)片、柴黃膠囊、柴黃片、心腦欣片，均為近6年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品。

1.3 試驗(yàn)菌種 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10104]、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CMCC（B）26003]、大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC（B）44102]、白色念珠菌Candida albicans[CMCC（F）98001]、黑曲霉Aspergillus niger[CMCC（F）98003]、乙型副傷寒沙門菌Salmonella paratyphi B [CMCC（B）50094]。菌種均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，菌株傳代數(shù)均為第Ⅲ代。

1.4 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），由美國(guó)BD公司提供。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法 本次研究對(duì)不同廠家的樣品按照《中國(guó)藥典》通則1105、1106、1107進(jìn)行了微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，最終確立微生物限度檢查檢驗(yàn)方法，具體如下。

2.1.1 磁朱丸 取本品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，振搖、研磨至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9ml，即為1∶100的供試液。同法10倍系列稀釋至1∶1000的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶100的供試液1ml，注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml，注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置23℃培養(yǎng)2小時(shí)，按供試液制備方式，將預(yù)培養(yǎng)物稀釋至1∶100和1∶1000的稀釋液。取含10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管3支，分別加入預(yù)培養(yǎng)后的1∶10、1∶100、1∶1000的稀釋液各1ml，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；沙門菌檢查，取本品10g，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基200ml中，使供試品分散均勻，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。

磁朱丸微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為：需氧菌總數(shù)不得過105cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過5×102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

2.1.2 板藍(lán)根片 取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml，即為1∶100的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml，注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版四部通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml，注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版四部通則1105平皿法）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版四部通則1106）。

板藍(lán)根片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為：需氧菌總數(shù)不得過103cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出。

2.1.3 小金丸、小金膠囊、小金片 取本品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，振搖，研磨至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9ml，即為1∶100的供試液。取1∶100的供試液2ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基8ml，即為1∶500的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶500的供試液1ml注皿，制備5份，合并計(jì)數(shù)，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置23℃培養(yǎng)2小時(shí)，按供試液制備方式，將預(yù)培養(yǎng)物稀釋至1∶100和1∶1000的稀釋液，取含10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管3支，分別加入預(yù)培養(yǎng)后的1∶10、1∶100、1∶1000的稀釋液各1ml，依法檢查（中國(guó)藥典2015版通則1106）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；沙門菌檢查，取供試品10g，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基200ml中，使供試品分散均勻，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。

小金丸微生物限度標(biāo)準(zhǔn)為：需氧菌總數(shù)不得過3×104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

小金片、小金膠囊微生物限度標(biāo)準(zhǔn)相同，均為：需氧菌總數(shù)不得過104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

2.1.4 紅金消結(jié)膠囊、紅金消結(jié)片 取本品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，使供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基90ml中，即為1∶100的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶100的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置23℃培養(yǎng)2小時(shí)，按供試液制備方式，將預(yù)培養(yǎng)物稀釋至1∶100和1∶1000的稀釋液。取含10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管3支，分別加入預(yù)培養(yǎng)后的1∶10、1∶100、1∶1000的稀釋液各1ml，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；沙門菌檢查，取本品10g，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基200ml中，使供試品分散均勻，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。

紅金消結(jié)膠囊與紅金消結(jié)片標(biāo)準(zhǔn)相同，均為：需氧菌總數(shù)不得過104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

2.1.5 柴黃片、柴黃膠囊 取本品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9ml，即為1∶100的供試液；取1∶100的供試液1ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9ml，即為1∶1000的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置23℃培養(yǎng)2小時(shí)。按供試液制備方式，將預(yù)培養(yǎng)物稀釋至1∶100和1∶1000的稀釋液。取含10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管3支，分別加入預(yù)培養(yǎng)后的1∶10、1∶100、1∶1000的稀釋液各1ml，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；沙門菌檢查，取本品10g，置含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1000ml（柴黃膠囊培養(yǎng)基量為500ml）中，使供試品分散均勻，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。

柴黃膠囊和柴黃片標(biāo)準(zhǔn)相同，均為：需氧菌總數(shù)不得過104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

2.1.6 心腦欣片 取本品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液1ml，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9ml，即為1∶100的供試液。需氧菌總數(shù)測(cè)定，取1∶100的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定，取1∶10的供試液1ml注皿，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1105平皿法）；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，取1∶10的供試液置23℃培養(yǎng)2小時(shí)，按供試液制備方式，將預(yù)培養(yǎng)物稀釋至1∶100和1∶1000的稀釋液。取含10ml的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管3支，分別加入預(yù)培養(yǎng)后的1∶10、1∶100、1∶1000的稀釋液各1ml，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）；大腸埃希菌檢查，取1∶10的供試液10ml，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100ml中，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。沙門菌檢查，取本品10g，置胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基500ml中，使供試品分散均勻，依法檢查（中國(guó)藥典2020年版通則1106）。

心腦欣片標(biāo)準(zhǔn)為：需氧菌總數(shù)不得過104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g，大腸埃希菌1g中不得檢出，沙門菌10g中不得檢出。

2.2 結(jié)果與分析 選取歷年抽驗(yàn)比例最高的三家企業(yè)，以“品名+A/B/C”表示。所示數(shù)據(jù)為近六年國(guó)抽部分中成藥微生物限度檢查結(jié)果，包括需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌、大腸埃希菌。樣品涉及6類中成藥的10個(gè)品種，共計(jì)662批次，涵蓋了丸劑、片劑及膠囊劑等不同劑型，包括如原粉入藥、煮提濃縮等不同生產(chǎn)工藝。通過對(duì)其微生物學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，可見近年整體微生物限度合格率較高，600余批次的檢測(cè)中僅有2批次需氧菌總數(shù)不合格，1批次霉菌和酵母菌總數(shù)不合格，整體風(fēng)險(xiǎn)可控。見表1。

表1 近六年中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

以下將對(duì)歷年結(jié)果分別進(jìn)行匯總分析，探討各個(gè)品種的總體情況及可能存在的問題。

2016年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種為磁朱丸，45批次樣品分別來自河北龍海藥業(yè)有限公司等6個(gè)廠家，合格率100%。磁朱丸由磁石（煅）、朱砂和六神曲（炒）三味藥組成，經(jīng)由原料藥粉末配研后制備成丸，該品種批準(zhǔn)生產(chǎn)的劑型均為水丸。所有批次產(chǎn)品的微生物限度檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 2016年磁朱丸國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

由于磁朱丸制備工藝中涉及發(fā)酵類原粉入藥，限度標(biāo)準(zhǔn)較寬，所有檢驗(yàn)結(jié)果的菌落數(shù)指標(biāo)都遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)，且不同廠家批次之間差異不大，82%的樣品在試驗(yàn)中無菌落生長(zhǎng)，衛(wèi)生學(xué)總體質(zhì)量穩(wěn)定。

2017年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種為板藍(lán)根片，129批樣品分別來自大理白族自治州中藥制藥有限公司等7個(gè)廠家?？偤细衤?8.4%，有兩批次需氧菌總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，均來自C廠家。板藍(lán)根片以板藍(lán)根為原材料，經(jīng)水煮醇提后濃縮制備而成，劑型為糖衣片劑。所有批次產(chǎn)品的微生物限度檢查結(jié)果如表3所示。

表3 2017年板藍(lán)根片國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

板藍(lán)根片制備工藝是一個(gè)全提取的過程，“水煮醇提”的工藝相當(dāng)于對(duì)原料藥進(jìn)行了一次“除菌”。在此前提下，板藍(lán)根片C廠家有兩批次樣品需氧菌總數(shù)分別達(dá)到了80000cfu/g和29000cfu/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了103cfu/g的合格標(biāo)準(zhǔn)。且該廠家被抽驗(yàn)的12批次樣品中含菌量整體都超出其他廠家，說明該廠家生產(chǎn)過程中的微生物控制存在較大問題，不同批次控制程度差異較大，提示存在隨機(jī)性的生產(chǎn)質(zhì)控風(fēng)險(xiǎn)，已提示該企業(yè)及時(shí)查找問題，加強(qiáng)微生物污染風(fēng)險(xiǎn)管控。板藍(lán)根片A廠家被抽驗(yàn)批次數(shù)最多，占比達(dá)74%，且整體含菌量基本一致。除板藍(lán)根片C廠家以外，其他廠家的微生物限度檢查合格率均為100%。特別提示，在合格的基礎(chǔ)上，大多數(shù)批次的檢驗(yàn)過程中都有菌落生長(zhǎng)，說明“煎煮提取”的工藝可在一定程度上降低微生物負(fù)載，但難以完全殺滅耐熱微生物（如芽孢桿菌、霉菌和酵母菌孢子等）[5]。并且，如生產(chǎn)環(huán)境和關(guān)鍵工藝微生物污染控制不足還可能帶來外源性微生物污染，影響終產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量。

2018年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種有小金丸146批次，合格率100%；小金膠囊65批次，合格率98.5%，有1批霉菌和酵母菌總數(shù)超標(biāo)，來自廠家C；小金片24批次，合格率100%。

小金丸146批樣品分別來自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠等13家企業(yè)。小金丸由人工麝香、制草烏、地龍等十味藥制成，制備工藝中涉及原粉入藥。所有批次產(chǎn)品的微生物限度檢查結(jié)果如表4所示。146批樣品均符合規(guī)定，B廠家的40批樣品與H廠家的4批樣品的工藝穩(wěn)定性可進(jìn)一步加強(qiáng)控制。

表4 2018年小金丸國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

小金膠囊65批樣品分別來自健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司等3家企業(yè)。檢測(cè)結(jié)果詳見表5，64批結(jié)果均符合規(guī)定，廠家C的1批產(chǎn)品霉菌和酵母菌總數(shù)超標(biāo)。

表5 2018年小金膠囊和小金片國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

小金片24批樣品全部來自小金片A企業(yè)。檢測(cè)結(jié)果詳見表5，24批結(jié)果均符合規(guī)定。所有批次產(chǎn)品的微生物限度檢查結(jié)果如表5所示。

小金丸、小金膠囊與小金片三個(gè)品種處方一致，劑型不同，均包含原粉入藥，小金丸的需氧菌總數(shù)限度要求較小金膠囊與小金片更寬松。三個(gè)品種檢測(cè)中的含菌量存在一定差異，小金片所有批次均無菌落生長(zhǎng)，小金丸大多批次無菌落生長(zhǎng)，個(gè)別有菌落生長(zhǎng)的批次其含量也遠(yuǎn)低于限度要求。而小金膠囊不同廠家的檢測(cè)結(jié)果存在差異，涉及的三個(gè)廠家中小金膠囊B廠家的檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)與小金片、小金丸類似，C廠家有1批產(chǎn)品霉菌和酵母菌總數(shù)超標(biāo)，超標(biāo)結(jié)果為680cfu/g；廠家C共抽樣6批樣品，其余5批霉菌和酵母菌結(jié)果為＜10cfu/g，提示該廠家微生物污染的生產(chǎn)控制存在較大偶發(fā)性風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)查找并嚴(yán)格管控。A廠家的大多數(shù)批次都有菌落生長(zhǎng)，且含量不低，有些批次接近上限，在104cfu/g的水平上。結(jié)合該品種的處方工藝，A廠家的生產(chǎn)過程需要加強(qiáng)批次穩(wěn)定性的控制。

2019年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種有紅金消結(jié)膠囊31批次，合格率100%，樣品全部來自紅金消結(jié)膠囊A企業(yè)；紅金消結(jié)片97批次，合格率100%，樣品來自山東綠因藥業(yè)有限公司等三個(gè)廠家。

紅金消結(jié)膠囊由三七、柴胡和黑螞蟻等十味藥制成，其中五味研粉后進(jìn)行滅菌備用，另五味煎煮后制備稠膏，然后混合制成膠囊劑。紅金消結(jié)片與紅金消結(jié)膠囊處方相同，工藝類似，最終將滅菌后的原粉和煎煮制備的稠膏混合物制成片劑。所有批次產(chǎn)品的微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表6所示。

表6 2019年紅金消結(jié)膠囊及紅金消結(jié)片國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

紅金消結(jié)膠囊與紅金消結(jié)片雖然均有原粉直接入藥，但其制備過程中明確說明了原粉經(jīng)過了滅菌工藝。其限度檢測(cè)結(jié)果總體趨勢(shì)一致，大多批次無菌落生長(zhǎng)，個(gè)別有菌落生長(zhǎng)的樣品其含量大概在102cfu/g水平，遠(yuǎn)低于限度要求。

2020年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種有柴黃膠囊13批次，合格率100%，樣品來自柴黃膠囊A企業(yè)；柴黃片7批次，合格率100%，樣品來自柴黃片A企業(yè)。

柴黃膠囊和柴黃片處方相同，由柴胡和黃芩兩味藥制備而成。柴黃膠囊制備工藝中將藥材原粉滅菌后使用，柴黃片則是藥材原粉直接入藥。所有批次產(chǎn)品的微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表7所示。

表7 2020年柴黃膠囊及柴黃片國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

柴黃膠囊及柴黃片處方一致，劑型不同且二者制備工藝有較大差別，柴黃膠囊制備中涉及了原料的“預(yù)除菌”，而柴黃片沒有，二者的檢測(cè)結(jié)果卻相反，柴黃膠囊大多批次有菌落生長(zhǎng)，而柴黃片絕大多數(shù)無菌落生長(zhǎng)。

2021年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種心腦欣片105批次，合格率100%，樣品來自北京御生堂制藥有限公司等9個(gè)廠家。

心腦欣片由紅景天、枸杞子和沙棘鮮漿三味藥制備而成。制備工藝中紅景天醇提、枸杞子水煮后入藥，沙棘鮮漿在50℃濃縮后入藥。所有批次產(chǎn)品的微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表8所示。

表8 2021年心腦欣片國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查結(jié)果

根據(jù)心腦欣片的檢驗(yàn)結(jié)果，其整體含菌量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)，且批次間差異不大，整體質(zhì)量較為穩(wěn)定。50℃的原漿入藥也會(huì)起到一定的“除菌”作用，一定程度上會(huì)降低微生物載量。

3 討論

3.1 近六年中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢查方法學(xué)整體情況分析 近六年樣品整體涵蓋了中成藥的不同劑型及不同生產(chǎn)工藝，本文中針對(duì)各個(gè)品種進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)并進(jìn)行了分析，從結(jié)果來看，大多數(shù)中成藥的抑菌作用不是很強(qiáng)，對(duì)抑菌作用強(qiáng)的品種，菌落總數(shù)檢查可采用高稀釋級(jí)供試液，而控制菌檢查除了增加增菌液的體積外，還可以在增菌液中添加3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂，方法具有很強(qiáng)的參考意義，可為以后的中成藥微生物限度檢查方法學(xué)適用性提供參考。

3.2 近六年中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果整體情況分析 微生物限度的控制是保障口服制劑用藥安全的核心。中成藥物料和生產(chǎn)工藝都具有一定特殊性。

中成藥來源主要是中藥材，包括植物、動(dòng)物類內(nèi)臟、尸體及某些礦物質(zhì)。這些中藥材自身攜帶大量的微生物和蟲卵，特別是對(duì)那些有生藥粉直接入藥的制劑微生物污染風(fēng)險(xiǎn)較高[6]。生產(chǎn)過程中的水飛、煮提、醇提、濃縮等工藝，包括輔料的加入，都可能帶來微生物污染。

通過對(duì)歷年數(shù)據(jù)的比對(duì)可見，在合格率很高的前提下，藥物實(shí)際含菌量與標(biāo)準(zhǔn)相差很大，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的限度。一般藥品生產(chǎn)中原粉直接入藥的情況下，成品應(yīng)與飲片原粉的含菌量在相似的水平上。結(jié)合文獻(xiàn)中的一些數(shù)據(jù)[7-10]，飲片原粉的含菌量是較高的，而藥物實(shí)際含菌量，包括需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)。例如，2020年抽驗(yàn)品種柴黃片，黃芩原粉直接入藥的情況下，其微生物載量卻低于黃芩原粉滅菌后再入藥的柴黃膠囊，其可能原因?qū)⒃?.3中進(jìn)一步探討。

結(jié)合歷年品種，對(duì)于有原粉或原漿直接入藥的品種而言，其微生物載量應(yīng)該較高，而經(jīng)歷的“水煮醇提”“原粉滅菌”之類工藝的品種其微生物超標(biāo)可能性較小。

3.3 近六年中成藥國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)品種生產(chǎn)工藝對(duì)微生物限度結(jié)果的影響 本文中全提取的藥物和原粉入藥的藥物，檢驗(yàn)結(jié)果沒有明顯差別，甚至部分品種中原粉入藥的含菌量更低。其在制備中應(yīng)該是引入了非傳統(tǒng)工藝的一些滅菌方式。另有一些品種，都是原粉入藥，但有些工藝中明確提及原粉是在滅菌后入藥的。此外，還有一些品種雖未提到滅菌的過程，但其最終的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與前者相當(dāng)，分析其工藝中也引入了類似的滅菌步驟。

例如，2017年的板藍(lán)根片經(jīng)過了“水煮醇提”的除菌過程，但是檢驗(yàn)結(jié)果中絕大多數(shù)批次在合格的基礎(chǔ)上有菌落的生長(zhǎng)，需氧菌含量在10-102cfu/g居多，而例如“小金丸”這種含有大量菌群的飲片原粉直接入藥的品種，反而大多數(shù)批次的檢驗(yàn)中無任何菌落生長(zhǎng)。

再如紅金消結(jié)片和紅金消結(jié)膠囊雖然也涉及原粉入藥，其制備過程明確指出了會(huì)將原粉滅菌后備用，但是相比其他原粉入藥且制備中無滅菌工藝的藥物，微生物的載量水平卻差異不大，甚至更高。從這樣的結(jié)果趨勢(shì)可以看出，其他品種的藥物在生產(chǎn)過程中或者“終產(chǎn)品”也經(jīng)歷過類似的“滅菌過程”。結(jié)合現(xiàn)有的一些文獻(xiàn)[11-17]，可以了解到，包括輻射、蒸汽滅菌、微波滅菌等都是會(huì)用到的方式。有一些文獻(xiàn)表明，經(jīng)歷這些非傳統(tǒng)工藝后藥物質(zhì)量無明顯變化，但是缺乏更明確的對(duì)質(zhì)量無影響的研究論證。目前業(yè)界也正在開展非傳統(tǒng)除菌工藝對(duì)質(zhì)量影響的課題研究，為下一步更好的指導(dǎo)中成藥的微生物限度控制提供更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)支撐和方法指導(dǎo)[18-19]。

3.4 本文中所有品種的微生物限度檢查方法針對(duì)每個(gè)廠家都進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，如能將文中所列品種的微生物限度檢查方法收入到該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)微生物限度檢查項(xiàng)下，可明顯方便檢驗(yàn)。