運動干預NAFLD的分子機制研究述評
——基于ROS調(diào)節(jié)UPRmt的線粒體毒性興奮效應

張 媛，文 立，丁樹哲

（1.南京體育學院 運動健康學院，江蘇 南京 210014；2.上海交通大學 系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院運動轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，上海 200240；3.華東師范大學 青少年健康評價與運動干預教育部重點實驗室，上海 200241；4.華東師范大學 體育與健康學院，上海 200241）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是被嚴重低估的重大健康威脅，除會引發(fā)肝臟嚴重病變乃至癌變之外，還可能引發(fā)心血管及代謝疾病（Es‐tes et al.，2018）。據(jù)報道，由于生活方式的明顯改變，全球NAFLD患病率在近幾十年迅速增長。我國近1/3的人群患有NAFLD，其中10%～20%將發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（non alcoholic steato hepatitis，NASH），而 NAFLD發(fā)展為NASH為不可逆過程（Tarantino et al.，2020）。預計到2030年，我國NAFLD患者將達到3.15億，脂肪肝將成為我國慢性疾病防控中的最大負擔（Byrne et al.，2015；Tanaka et al.，2019）。盡管NAFLD的病理現(xiàn)象被高度關注，但目前尚無美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的治療NAFLD的藥物。運動是防治NAFLD經(jīng)濟有效的干預方式之一，有研究證實，在NAFLD誘發(fā)進程中進行有效的運動、膳食干預對逆轉(zhuǎn)NAFLD至關重要。有氧運動、抗阻運動或是簡單的身體鍛煉均可改善NAFLD（Hajighasem et al.，2019；Hashida et al.，2017；Oh et al.，2017）。運動不僅可以改善肝功能，降低NAFLD由輕度向重度轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)標志物水平，是治療和預防NAFLD經(jīng)濟有效的干預方式，而且可以降低患心血管疾病、糖尿病及高血壓的風險（Farzanegi et al.，2019；van der Windt et al.，2018）。氧化應激與NAFLD密切相關，線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多可改變細胞氧化應激水平，過高ROS會擾亂線粒體蛋白環(huán)境，加劇線粒體損傷。而適量ROS對激活細胞和有機體的適應性反應有益，這種劑量效應表現(xiàn)為線粒體毒性興奮效應。本文圍繞NAFLD發(fā)展過程中氧化應激水平改變及其調(diào)控的線粒體未折疊蛋白反應（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt），綜述運動預防、逆轉(zhuǎn)NAFLD的生物學機制，揭示線粒體毒性興奮效應在預防NAFLD發(fā)生發(fā)展中的規(guī)律，為NAFLD的防治提供理論依據(jù)。

1 氧化應激與炎癥是NAFLD發(fā)展的核心環(huán)節(jié)

目前，NAFLD的發(fā)病機制尚不完全清楚。研究表明，其與多種繼發(fā)性并發(fā)癥密切相關，如胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、肥胖、高血壓、血脂異常、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）及心血管疾病等，其中肥胖是最重要的NAFLD誘發(fā)因素（Neuschwander‐Tetri，2017；Sar‐war et al.，2018）。傳統(tǒng)的“兩次打擊”理論，即第一次打擊為肝臟脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗，第二次打擊為氧化應激，其在一定程度上解釋了NAFLD的發(fā)病機制（Rolo et al.，2012；Serviddio et al.，2013）。之后，“多重打擊”理論即從遺傳易感性、表觀遺傳、肝細胞內(nèi)代謝、肝細胞內(nèi)的細胞互作、脂肪組織等多方面考慮了諸多因素并行的作用效果，其中，氧化應激被認為是造成“多重打擊”的重要誘因，是導致NAFLD發(fā)展中肝臟損傷的主要因素（Fried‐man，2018）。氧化應激反應是細胞內(nèi)ROS與抗氧化系統(tǒng)清除能力不平衡的結果（Takaki et al.，2013）。肝內(nèi)脂質(zhì)超載可激活多個ROS生成通路導致氧化物過量生成，高水平ROS影響細胞大分子（DNA、脂類、蛋白質(zhì)等）的氧化修飾，致使大分子損傷積累，引起肝損傷（Rolo et al.，2012；Serviddio et al.，2013）。另一方面，ROS信號可能在正常生理過程中發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)或參與穩(wěn)態(tài)應激反應、代償性適應代謝功能障礙和炎癥反應等（Forrester et al.，2018；van der Vliet et al.，2018）。可見，ROS信號介導的NAFLD發(fā)生發(fā)展機制及特異性分子途徑仍不清晰，有待進一步研究。

1.1 肝臟脂質(zhì)代謝異常與氧化應激

脂肪代謝不平衡是誘發(fā)NAFLD的直接病因，闡明肝臟能量代謝底物——游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）的來源及去路是深入了解NAFLD潛在致病機制的根源（Chen et al.，2019）。研究表明，導致肝臟脂肪沉積的FFAs約超過一半來自外周脂肪分解或未酯化脂肪酸（nonester‐ifed fatty acid，NEFA）庫（Arab et al.，2018）。胰島素可調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯分解，NAFLD中外周組織胰島素敏感性和葡萄糖利用率較低，而IR并未降低脂肪組織的脂解作用，因此導致NEFA過度分配至肝臟（Samuel et al.，2018）。肝臟FFAs第二大來源為脂肪從頭合成（de novo lipogenesis，DNL），即由肝臟細胞將多余葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸的過程。Donnelly等（2005）的同位素標記實驗發(fā)現(xiàn)，NAFLD中肝臟增加的脂肪主要來自于DNL作用。Samuel等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌IR會導致高血糖癥和高胰島素血癥，兩者作用可激活肝細胞碳水化合物反應元件結合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）及轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP‐1）活性，提高脂肪合成酶表達水平，使肝臟合成FFAs增加。另一方面，F(xiàn)FAs的清除是決定FFAs穩(wěn)態(tài)的另一重要環(huán)節(jié)。肝臟FFAs主要通過線粒體β氧化和再酯化合成甘油三酯進一步代謝（Arab et al.，2018）。甘油三酯是形成肝臟脂滴的主要脂類物質(zhì)，能夠以極低密度脂蛋白（very low densi‐ty lipoprotein，VLDL）的形式輸出（圖1）。

圖1 NAFLD脂代謝與氧化應激Figure 1.Lipid Metabolism and Oxidative Stress in NAFLD

過量FFAs將作為底物生成脂毒性物質(zhì)，如神經(jīng)酰胺、甘油二酯及溶血卵磷脂等，最終引起代謝應激、炎癥反應及細胞死亡（Friedman et al.，2018；Chen et al.，2019）。氧化應激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。ROS是不同類型肝細胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物，包括不斷生成的超氧化物陰離子（O·）和過氧化氫（HO）等物質(zhì)（Ma‐sarone et al.，2018）。ROS含量過高可使肝內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞。臨床與動物實驗通常將血液或肝臟組織中氧化應激與抗氧化物的標志性產(chǎn)物水平作為評價NAFLD/NASH氧化應激狀態(tài)的依據(jù)。氧化應激標志物主要包括脂質(zhì)損害產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reac‐tive substance，TBARS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、4-羥基壬烯醛（4‐hydroxynonenal，4‐HNE）、氫過氧化物和 8-異前列烷、DNA氧化產(chǎn)物（8-羥基脫氧鳥苷）、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物（蛋白質(zhì)羰基、硝基酪氨酸）等，抗氧化物主要含有谷胱甘肽（glutathione，GSH）、抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‐Px）等。

1.2 NAFLD發(fā)展過程中線粒體功能變化

肝細胞的能量穩(wěn)態(tài)主要受線粒體氧化代謝調(diào)節(jié)，包括β氧化、三羧酸循環(huán)、生酮作用、電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）活性與 ATP 合成等（Sunny et al.，2017）。NAFLD早期肝細胞內(nèi)FFAs內(nèi)流迅速增加，引起多種激素和代謝發(fā)生改變，增強線粒體脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）作用，是代償性降低肝臟脂肪積累的適應性表現(xiàn)。大多研究表明，營養(yǎng)過剩的小鼠模型中肝臟線粒體β氧化顯著增高，而有些研究結果出現(xiàn)差異性的原因可能在于高脂膳食的飲食成分、干預時長、小鼠基因背景以及檢測FAO的方法有所不同。另外，NAFLD病情發(fā)展程度不同，線粒體功能亦有所差異。Kakimoto等（2019）研究表明，肝臟線粒體FAO能力在高脂膳食（high fat diet，HFD）喂養(yǎng)4周時有所降低，而在喂養(yǎng)8周時卻得以恢復，提示高脂膳食誘導代謝受損的肝臟線粒體功能具有重塑性。而NAFLD初期肝臟脂肪變性所伴隨的高水平線粒體FAO機制還有待進一步研究。目前研究提示，高水平線粒體FAO可能與肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltrans‐ferase‐I，CPT‐1）活性及過氧化物酶體增殖激活受體 α（per‐oxisome proliferator‐activated receptor α，PPARα）表達水平增高、肝臟IR的發(fā)生、瘦素等激素水平增高以及FGF21有關（Satapati et al.，2012；Schuster et al.，2018）。

研究表明，不同NAFLD或NASH階段的肝臟線粒體ETC復合物活性、耗氧率、氧化磷酸化（oxidative phosphor‐ylation，OXPHOS）效率以及線粒體膜電位呈現(xiàn)不同變化特征。導致這些差異的原因可能與疾病病程肝臟氧化應激程度不同有關，如Koliaki等（2015）發(fā)現(xiàn)，肝臟線粒體OXPHOS效率在簡單脂肪變性機體中顯著增高，而在NASH患者中顯著下降?；蚴菟厝毕輔b/ob小鼠和瘦素抵抗db/db小鼠以中度肝炎癥和輕度纖維化為特征（Fried‐man et al.，2018），其肝臟線粒體氧化能力有所增強，而ETC復合物活性被顯著抑制，NASH小鼠的肝臟線粒體ETC明顯受損（Cheng et al.，2009；Finocchietto et al.，2011）。由此得出：ETC活性伴隨NAFLD發(fā)展逐漸下降，而線粒體FAO作用在NAFLD和NASH中均顯著增高。這種在NAFLD發(fā)展過程中出現(xiàn)的線粒體FAO作用代償性增強，而ETC并未隨之上調(diào)，即FAO與ETC不協(xié)調(diào)的現(xiàn)象最終導致更多底物衍生的還原當量進入受損ETC產(chǎn)生電子漏，致使ROS生成增多（Begriche et al.，2013）。

1.3 氧化應激與線粒體功能的惡性循環(huán)

細胞、動物、人體等不同水平研究表明，線粒體ROS水平增高是線粒體功能受損，導致NAFLD的主要原因之一（Farzanegi et al.，2019；Simoes et al.，2018；Spahis et al.，2017）。線粒體ROS釋放可通過磷酸化和轉(zhuǎn)錄因子等多種修飾作用調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)氧化應激環(huán)境，以維持線粒體完整性和生物穩(wěn)態(tài)（Forrester et al.，2018；Vercesi et al.，2018）。不同ROS水平可調(diào)節(jié)不同類型信號分子，從細胞生物適應到細胞死亡（Figueira et al.，2013），高水平ROS會導致大分子非特異性受損，通常將產(chǎn)生更多中間產(chǎn)物并觸發(fā)一系列放大損傷效應，加快疾病進展（Rolo et al.，2012；Serviddio et al.，2013）。

脂質(zhì)過氧化是NASH發(fā)展的主要誘因之一。研究表明，NAFLD患者的循環(huán)血液中已出現(xiàn)多個脂質(zhì)過氧化的生物標記物，如MDA、4‐HNE，其濃度與NAFLD發(fā)展程度成正相關（Liu et al.，2011；Svegliati‐Baroni et al.，2019），與 NASH 組織學特征高度相關（Albano et al.，2005；Bel‐lanti et al.，2017）。有研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化物可損傷線粒體膜，使正常ETC受損（Masarone et al.，2018）。此外，作為線粒體內(nèi)膜的重要磷酸分子——心磷脂，對氧化損傷十分敏感，極易改變線粒體膜的流動性與穩(wěn)定性，導致ETC復合物活性下降（Li et al.，2010），為觸發(fā)caspase介導的細胞凋亡通路提供條件（Kagan et al.，2005）。除了脂類物質(zhì)的影響，線粒體內(nèi)膜生成的O·和HO也較易與臨近的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）相結合，導致DNA缺失和點突變，并加劇線粒體損傷（Borrelli et al.，2018）。因此，ROS引起的mtDNA受損與突變可改變ETC活性，觸發(fā)線粒體ROS生成增多，使損傷程度進一步擴大。損傷后的線粒體ETC被抑制，同時膜結構完整性被進一步破壞，引發(fā)線粒體源性氧化應激的惡性循環(huán)，而終止這一惡性循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)是提供外源性干預，幫助線粒體恢復氧化應激穩(wěn)態(tài)，重塑線粒體功能。

2 ROS調(diào)節(jié)UPRmt的線粒體毒性興奮效應

2.1 誘發(fā)UPRmt的關鍵調(diào)控機制

線粒體依賴于一個復雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)，使其在細胞能量供應、代謝、凋亡等諸多方面發(fā)揮重要作用（Moehle et al.，2019）。線粒體蛋白質(zhì)受細胞核與線粒體兩套基因組編碼，約1 100個線粒體蛋白中除13個受mtDNA編碼外，絕大多數(shù)線粒體蛋白由細胞核編碼，需通過線粒體蛋白輸入機制進入線粒體內(nèi)部（Zhang et al.，2020）。線粒體ETC在能量生成過程中產(chǎn)生的ROS，不僅可干擾OXPHOS過程，同時也會損害線粒體蛋白、脂質(zhì)及mtDNA（Moehle et al.，2019）。為了建立與維持最佳蛋白環(huán)境，線粒體需要通過多鐘機制維持蛋白環(huán)境穩(wěn)態(tài)，若蛋白穩(wěn)定防御途徑受損將對機體健康產(chǎn)生重大影響。

UPRmt是由于線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)被破壞，發(fā)生多種蛋白毒性應激，最終啟動相關基因表達程序，上調(diào)線粒體特異性伴侶蛋白和蛋白酶等靶基因，以恢復線粒體內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)的過程（Yi et al.，2018）。UPRmt機制最初在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，并一直被高度關注，之后在線蟲中被充分研究。研究發(fā)現(xiàn)，激活轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription fac‐tor 4，ATF4）和激活轉(zhuǎn)錄因子 5（activating transcription fac‐tor 5，ATF5）是哺乳動物線粒體應激反應與UPRmt的關鍵調(diào)控因子（Fiorese et al.，2016；Quiros et al.，2017）。UP‐Rmt機制通過感知蛋白毒性應激開啟線粒體-細胞核對話，誘導細胞做出適應性應答，從而改善蛋白折疊應激，重建線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。哺乳動物的UPRmt與綜合應激反應（integrated stress response，ISR）密切相關。線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)失衡使真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation fac‐tor 2，eIF2α）被磷酸化，進而導致蛋白質(zhì)合成減少，但可通過調(diào)節(jié)ATF4、ATF5 mRNA中5’UTR非翻譯區(qū)上游開放閱讀框架（upstream open reading frames，uORFs），選擇性啟動ATF4、ATF5等基因翻譯，隨后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多個線粒體伴侶蛋白和線粒體蛋白酶，提高線粒體蛋白含量折疊能力，恢復線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)（Melber et al.，2018）（圖2）。

圖2 哺乳動物UPRmt機制Figure 2.UPRmt Mechanism in Mammalian

2.2 UPRmt與線粒體毒性興奮效應

生物體內(nèi)的毒性興奮效應（hormesis）指低劑量壓力刺激可激活細胞和有機體的適應性反應以維持體內(nèi)平衡，促進健康甚至延長壽命，而超過閾值的高劑量刺激則導致細胞損傷的一種現(xiàn)象，其與刺激源之間的關系不同于簡單的線性關系，而通常表現(xiàn)為鐘形或倒U性曲線。近年來，毒性興奮效應的理論已擴展至線粒體水平。2006年，“線粒體毒性興奮效應”（mitohormesis）的概念首次被提出（Tapia，2006；Yi et al.，2018），即對線粒體穩(wěn)態(tài)的輕度擾動會促進與協(xié)調(diào)線粒體-細胞核之間的“對話”，降低細胞對外來刺激源的敏感性，提高細胞抵御刺激的能力。

多種刺激源可誘發(fā)線粒體產(chǎn)生毒性興奮效應，例如線粒體ROS水平升高，ATP、Ca和NAD等代謝產(chǎn)物增加、線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)失衡等。其中，ROS生成是線粒體與細胞核“對話”的重要信號因子之一，也是調(diào)節(jié)線粒體毒性興奮效應的主要信號。研究發(fā)現(xiàn)，ROS與UPRmt可能在誘發(fā)線粒體毒性興奮效應中發(fā)揮協(xié)同作用，ROS‐UPRmt線粒體毒性興奮效應信號對維持線粒體穩(wěn)態(tài)至關重要（Monaghan et al.，2015）。Dillin等（2002）早期針對低等動物研究表明，擾亂核編碼的線粒體OXPHOS復合物I、Ⅲ和Ⅳ，或通過限制葡萄糖攝入誘導低等動物體內(nèi)ROS水平小幅度增高，均可激活UPRmt過程及線粒體毒性興奮效應，延長蠕蟲壽命。Gariani等（2016）同樣發(fā)現(xiàn)，補充NAD生物合成的前體物質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可通過Sirt介導的UPRmt啟動線粒體毒性興奮效應，改善高脂高糖膳食小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積。此外，人體實驗中，Ristow等（2009）發(fā)現(xiàn)，運動訓練引起ROS水平適度增高，使機體胰島素敏感性提高，而服用抗氧化劑對包括糖尿病在內(nèi)的多種病理現(xiàn)象并無顯著療效（Kawagishi et al.，2014；Ristow et al.，2009）。因此，中度或短暫的線粒體應激將誘導蠕蟲和哺乳動物發(fā)生UPRmt及線粒體毒性興奮效應。這一機制可能以細胞自主和非自主的方式對宿主提供保護或發(fā)揮積極作用，對維持機體穩(wěn)態(tài)至關重要。由此可見，研究UPRmt的調(diào)節(jié)機制對改善或預防代謝惡化及脂肪肝疾病的發(fā)生發(fā)展意義重大，深入探究UPRmt及線粒體毒性興奮效應的上游調(diào)控機制可為探索人類脂肪肝疾病新治療策略提供線索。

2.3 UPRmt激活與線粒體因子分泌

UPRmt的觸發(fā)可能與組織或器官釋放某些關鍵信號因子相關，即線粒體不僅通過UPRmt恢復穩(wěn)態(tài)，同時也會發(fā)出“求救”信號，由發(fā)生線粒體應激的細胞釋放一類核編碼的信號分子至遠處組織發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用（Mottis et al.，2019；Yi，2019），這類分子被稱為線粒體因子（mito‐kines）。線粒體與遠處組織的通訊正是通過線粒體因子得以實現(xiàn)，但具體分子機制尚不清楚。

線粒體因子分泌水平與慢性肝病和心血管疾病風險密切相關，是預測NAFLD、NASH和晚期肝纖維化等肝臟疾病的標志分子（Conte et al.，2019；Yi，2019）。成纖維細胞生長因子 21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF21）與生長分化因子 15（growth differentiation factor15，GDF15）被認為是調(diào)節(jié)糖脂代謝以及胰島素敏感性的內(nèi)分泌因子，其分泌水平與線粒體功能狀態(tài)密切相關（Conte et al.，2019；Klaus et al.，2020）。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21和GDF15的分泌過程均依賴于激活elF2α磷酸化及其下游ATF4，而這一通路是激活 UPRmt的主要途徑（Coll et al.，2019；Lewis et al.，2019；Munch，2018；Naresh et al.，2019）。在哺乳動物細胞中，線粒體的多種損傷（包括蛋白毒性應激和ROS）通過線粒體應激反應（mitochondrial stress response，MSR）發(fā)出信號?；罨囊话阈哉{(diào)控阻遏蛋白激酶2（general control nonderepressible 2 kinase，GCN2）可磷酸化elF2α，使蛋白質(zhì)翻譯過程減速，啟動ATF4、ATF5和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP的同源蛋白（C/EBP‐homologous protein，CHOP）表達（Munch，2018；Naresh et al.，2019）。在小鼠模型中，血液循環(huán)的FGF21和GDF15主要來源于肝臟組織的分泌，隨后至外周組織，在受體細胞中激發(fā)特定效應。例如，Coll等（2019）在兩項獨立的隨機對照臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可提高受試者循環(huán)GDF15水平，通過腦干組織中GDNF家族 α 樣受體（GDNF‐family receptor α‐like，GFRAL）減少食物攝入并降低體質(zhì)量，證實了血液循環(huán)中GDF15的水平對于機體維持能量平衡和體質(zhì)量的重要性。

可見，UPRmt激活是線粒體因子分泌的誘因，是細胞應對線粒體應激引起能源危機的合理應答，對維持細胞代謝穩(wěn)態(tài)至關重要。然而，UPRmt觸發(fā)與線粒體因子分泌的關系仍不清楚，其分泌水平在UPRmt被激活的早期或晚期階段所呈現(xiàn)的變化規(guī)律仍較模糊。

3 運動干預NAFLD的內(nèi)在機制探討

UPRmt與多種由蛋白毒性應激導致線粒體功能障礙的病理現(xiàn)象有關，包括NAFLD（Ortiz et al.，2020；Teodoro et al.，2013）。雖然UPRmt是NAFLD進展中維持與調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)態(tài)的重要機制，但目前對臨床前期與臨床階段患者的研究仍不夠深入（Yi，2019）。Gariani等（2016）報道，高脂（44.6%）高糖（40.6%）膳食（hgh fat high sugar，HFHS）模型具有脂肪變性所致線粒體功能障礙的特點，并伴隨炎癥、纖維化標志物mRNA表達水平增高，但并未改變UPRmt標志物的mRNA水平，如酪蛋白水解蛋白酶P（ca‐seinolytic protease P，ClpP）、熱休克蛋白 10（heat shock pro‐tein 10，Hsp10）和熱休克蛋白 60（heat shock protein 60，Hsp60）等。有趣的是，補充NAD前體物質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可誘發(fā)UPRmt，并顯著改善HFHS膳食引起的慢性肝臟脂肪異常沉積。這一研究提示，改變UPRmt水平是干預 NAFLD 的重要手段之一（Urbina‐Varela et al.，2020）。此外，研究發(fā)現(xiàn)，受損的UPRmt可導致肝細胞發(fā)生衰老，使肝硬化伴隨代償失常，在細胞培養(yǎng)實驗中若通過恢復線粒體蛋白酶ClpP水平，上調(diào)UPRmt作用，即可激活線粒體毒性興奮效應，從而防止肝細胞衰老，并有效改善肝細胞功能（Luo et al.，2021；Sen et al.，2019）。

肝臟氧化應激調(diào)節(jié)UPRmt的線粒體毒性興奮作用，與肝臟脂質(zhì)沉積密切相關。運動提高肝臟脂肪氧化水平，緩解脂質(zhì)沉積是運動調(diào)節(jié)UPRmt的本質(zhì)因素。運動對UPRmt的調(diào)節(jié)作用主要體現(xiàn)在運動改善肝臟氧化應激，增強線粒體-細胞核“對話”，促進線粒體因子分泌等方面（圖3）。

圖3 運動調(diào)節(jié)UPRmt逆轉(zhuǎn)NAFLD的內(nèi)在機制Figure 3.Mechanism of Exercise Regulates UPRmt and Reverses NAFLD

3.1 運動降低肝臟脂質(zhì)沉積，改善肝臟氧化應激水平

肝臟組織中氧化應激是導致肝細胞死亡和組織損傷的重要機制。NAFLD中肝臟線粒體異常，抗氧化酶下調(diào)，白細胞積累和肝臟炎癥均是導致ROS生產(chǎn)過剩的主要原因。ROS過量產(chǎn)生不僅會引起脂質(zhì)過氧化，導致炎癥和纖維形成，而且抑制肝細胞分泌VLDL，進一步誘導肝臟脂肪堆積。運動改善肝臟氧化應激水平可通過緩解肝臟脂質(zhì)沉積及增強肝臟細胞抗氧化能力兩方面發(fā)揮作用。運動對肝臟脂質(zhì)含量的調(diào)節(jié)作用體現(xiàn)在以下方面：1）運動提高機體胰島素敏感性，減少FFA向肝臟的輸入量，降低脂肪合成底物水平（Cuthbertson et al.，2016）。諸多人體實驗表明，運動是改善IR緩解NAFLD的有效方法（Bacchi et al.，2013；Oh et al.，2015a，2015b；Sullivan et al.，2012；Sun et al.，2012）。2），運動下調(diào)SREBP‐1表達水平，降低脂肪合成酶活性，抑制肝臟脂肪合成（Cintra et al.，2018；Wu et al.，2015）。Oh等（2017）對中年肥胖男子進行不同強度、頻率的運動干預研究發(fā)現(xiàn)，12周抗阻訓練或高強度有氧訓練干預均可使循環(huán)外周血液單核細胞SREBP‐1c表達降低，下調(diào)脂肪肝患者肝臟FFA從頭合成。運動還可顯著降低肝臟脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）和硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl‐CoA desaturase 1，SCD1）表達水平，使FFA水平下降，逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性（Suk et al.，2015；Tsuzuki et al.，2015；Wu et al.，2015），提高乙酰輔酶A羧化酶（acetylCoA carboxylase，ACC）磷酸化，抑制脂肪合成（Cho et al.，2014）。3），運動提高參與線粒體脂肪氧化的肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyltransferase‐1，CPT‐1）、乙酰輔酶 A 脫氫酶（acetyl CoA dehydrogenase，ACD）活性，加速脂肪分解，同時降低線粒體氧化應激水平，提高線粒體β氧化能力（Stevanovic et al.，2020；Zheng et al.，2019）。

運動不僅能夠調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝水平，而且對機體抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用比補充抗氧化劑的效果更佳。運動激活細胞ROS生成也是運動激活抗氧化系統(tǒng)的機制之一。運動可適度提高細胞ROS水平，通過多種途徑激活抗氧化系統(tǒng)。運動還可激活腺苷酸活化蛋白激酶［ade‐nosine 5’‐monophosphate（AMP）‐activated protein kinase，AMPK］及沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）通路（Cardaci et al.，2012），作用于過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（peroxisome prolifer‐ators‐activated receptor γ coactivator 1α，PGC‐1α），上調(diào)抗氧化防御系統(tǒng)主要因子表達水平，如核因子E2相關因子2（nuclear respiratory factor 2，Nrf2），提高其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的諸多抗氧化因子表達水平，包括：醌氧化還原酶1［NAD（P）H quinone oxidoreductase 1，NQO1］、血紅素氧合酶1（heme oxygenase‐1，HO‐1）、SOD、CAT 及 GSH‐Px 氧化還原反應系統(tǒng)（Kasai et al.，2020；Vargas‐Mendoza et al.，2019）。Chartoumpekis等（2013）和Chowdhry等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD模型中，敲除Nrf2基因的小鼠NASH發(fā)生率更高。相反，激活Nrf2可逆轉(zhuǎn)高脂肪和高果糖食物喂養(yǎng)小鼠的IR、肝臟脂肪變性和纖維化（Sharma et al.，2018）。近期Dludla等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，ROS抑制劑——N-乙酰半胱氨酸（N‐acetyl cysteine，NAC）可顯著抑制NAFLD動物模型肝臟脂肪堆積，這一作用主要通過對脂肪酸膜轉(zhuǎn)運蛋白CD36和轉(zhuǎn)錄因子SREBP‐1c/‐2及PPARα的調(diào)節(jié)作用。因此，通過運動干預調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)活性，改變氧化應激環(huán)境是改善NAFLD的有效途徑之一。

3.2 運動維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)，增強線粒體-細胞核“對話”

作為細胞的能量和代謝中心，線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的失衡與線粒體功能障礙是衰老和衰老相關疾病發(fā)生的重要因素，線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)失衡與功能障礙的發(fā)生可能互為因果，但它們之間相互聯(lián)系的具體機制尚不清楚（Andere‐asson et al.，2019；Li et al.，2019；Urbina‐Varela et al.，2020）。線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)維持受到線粒體蛋白輸入機制（protein import machinery，PIM）、線粒體自噬及UPRmt等多方面影響（Zhang et al.，2020）。其中，UPRmt機制是通過感知蛋白毒性應激開啟線粒體-細胞核“對話”，誘導細胞做出適應性應答，從而改善蛋白折疊應激，重建線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的過程。目前，尚不清楚錯誤折疊或受損蛋白質(zhì)如何被UPRmt識別。較為普遍的觀點認為，激活轉(zhuǎn)錄因子 1（activating transcription factor 1，ATF1）是誘發(fā) UP‐Rmt的“信使”，其對線粒體蛋白輸入效率極為敏感，正常情況下，線粒體蛋白輸入效率較高時，ATF1蛋白中N末端的靶向序列將新生的ATF1蛋白順利輸入至線粒體內(nèi)部，隨后被線粒體蛋白酶LONP降解。當線粒體處于應激狀態(tài)時，蛋白輸入效率的降低導致其在細胞質(zhì)中大量堆積，ATF1蛋白C末端序列將ATF1輸入至細胞核，進而激活使線粒體蛋白恢復穩(wěn)態(tài)的相關轉(zhuǎn)錄基因表達，最終改善線粒體和細胞狀態(tài)（Naresh et al.，2019）。

運動調(diào)節(jié)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的作用在骨骼肌組織中已被充分證實。早期研究發(fā)現(xiàn)，運動可調(diào)節(jié)PGC‐1α表達，增強線粒體-細胞核之間相互作用，協(xié)調(diào)線粒體生物發(fā)生（Safdar et al.，2011）。近些年，研究發(fā)現(xiàn)，衰老骨骼肌中線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)失衡是發(fā)生肌少癥的主要原因之一，而運動可改善衰老骨骼肌線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)，延緩肌少癥癥狀（Coen et al.，2019；Liu et al.2021；Picca et al.，2019）。由此可見，運動對維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)發(fā)揮積極作用。1）運動增加線粒體蛋白輸入組件蛋白表達水平，使核編碼的線粒體蛋白靶向性輸入至線粒體不同區(qū)域發(fā)揮功能，這一發(fā)現(xiàn)在老年鼠實驗中也同樣被證實（Zhang et al.，2013）。2）運動提高線粒體自噬作用，促進線粒體更新，提高線粒體蛋白質(zhì)量，緩解線粒體應激（Sorriento et al.，2021）。3）運動可調(diào)節(jié)線粒體-細胞核“對話”，上調(diào)UP‐Rmt標志性蛋白，激活UPRmt。運動對UPRmt的調(diào)節(jié)作用在許多組織中均有報道：Cordeiro等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動訓練及高強度間歇訓練可提高衰老小鼠的全身代謝水平，同時使線粒體與細胞核之間失衡，顯著提高骨骼肌組織HSP60、LONP和線粒體蛋白酶Yme1L1等UP‐Rmt標志物含量。Braga等（2021）發(fā)現(xiàn)，運動可改變線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)，上調(diào)下丘腦UPRmt標志物表達水平及線粒體最大呼吸能力。Santos‐Alves等（2015）報道，運動可調(diào)節(jié)肝臟線粒體質(zhì)量相關蛋白表達，促進肝細胞更新、重塑?；赨PRmt在肝臟組織中的作用研究發(fā)現(xiàn)，補充煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可激活肝臟UPRmt，顯著降低脂肪肝的發(fā)生（Garianik et al.，2016）。相反，過表達UPRmt關鍵線粒體蛋白酶ClpP（Sen et al.，2019）或基因敲除ClpP（Bhaskaran et al.，2018）均能夠上調(diào)UPRmt作用，改善衰老肝細胞代謝，抑制高脂膳食誘導的脂肪肝及IR現(xiàn)象，體現(xiàn)出線粒體毒性興奮效應。此外，Yang等（2020）近期報道，miR‐29a可抑制GSK3β，降低SIRT1介導的線粒體生物發(fā)生，緩解線粒體蛋白應激與UPRmt水平，是治療NAFLD的靶治療因子。由此可見，UPRmt在調(diào)節(jié)肝細胞代謝中亦發(fā)揮重要作用，深入研究運動對肝組織UPRmt的調(diào)節(jié)機制將有助于進一步揭示線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)在運動干預NAFLD發(fā)生發(fā)展中的生物學機制。

3.3 運動調(diào)節(jié)UPRmt水平，促進線粒體因子分泌

雖然目前有關運動調(diào)節(jié)肝臟組織UPRmt的研究較少，更多關注運動緩解肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應（endo‐plasmic reticulum unfolded protein response，UPRer）（Este‐banez et al.，2018；Zou et al.，2020）及提高線粒體功能的作用（Goncalves et al.，2013，2014；Stevanovic et al.，2020），但隨著研究不斷深入，運動對肝臟線粒體功能及UPRmt的調(diào)節(jié)作用越來越受到關注。由于線粒體因子分泌的調(diào)節(jié)依賴于激活elF2α磷酸化及其下游ATF4‐CHOP軸，即UP‐Rmt機制。由此推測，運動促進線粒體因子釋放與UP‐Rmt、線粒體毒性興奮效應密切相關。近年來，隨著對FGF21和GDF15等線粒體因子的研究逐步深入，多組織間“對話”逐漸清晰，運動可促進諸多肝臟線粒體因子分泌，參與糖脂代謝調(diào)節(jié)（Seo et al.，2021）。這些因子被廣泛應用于肝臟糖脂代謝及心血管疾病的預防與康復研究，有望成為有效干預靶點之一。運動干預、食物限制、服用二甲雙胍等手段對刺激線粒體因子分泌作用顯著，大量圍繞運動調(diào)節(jié)線粒體因子分泌的研究陸續(xù)展開（Conte et al.，2020；Geng et al.，2019；Gonzalez‐Gil et al.，2020；Klaus et al.，2021）。目前研究大多聚焦不同運動方式刺激后線粒體因子分泌的來源及水平變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，肌肉在進行亞極量運動或最大離心收縮時，肝臟組織是循環(huán)血液中FGF21的主要來源，而非骨骼肌組織，且骨骼肌FGF21蛋白含量沒有發(fā)生變化（Hansen et al.，2015；Parmar et al.，2018）。同樣發(fā)現(xiàn)一次性急性運動可顯著提高肝臟釋放GDF15因子（Kleinert et al.，2018）。也有研究報道運動誘導線粒體因子分泌參與代謝調(diào)節(jié)的機制，例如，運動可提高肥胖個體脂肪組織成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）及其輔受體（klotho beta，KLB）表達水平，增加FGF21敏感性，降低血液循環(huán)中FFAs含量與炎癥反應，增強脂肪酸氧化水平，減少肝臟、骨骼肌中脂肪異位沉積（Lewis et al.，2019）。Gao等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，運動伴隨的骨骼肌收縮可促進FGF21分泌，其調(diào)節(jié)肝臟AMPK介導的脂滴自噬作用，是改善高脂膳食導致肝臟脂質(zhì)代謝異常的重要機制。

4 結論

綜上所述，氧化應激是NAFLD發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，NAFLD發(fā)生發(fā)展中，較低ROS水平可激活UPRmt，使線粒體產(chǎn)生毒性興奮效應，此時期為線粒體穩(wěn)態(tài)自我修復的關鍵期。相反，若無外源性干預，肝細胞氧化應激持續(xù)加劇，過高水平ROS反而使UPRmt作用消退，導致線粒體穩(wěn)態(tài)失衡，NAFLD發(fā)展進一步惡化。運動干預通過改善肝臟氧化應激、增強線粒體-細胞核“對話”及促進線粒體因子分泌等途徑，調(diào)節(jié)UPRmt水平，激活線粒體毒性興奮效應，在逆轉(zhuǎn)NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用（圖4）。

圖4 運動調(diào)節(jié)UPRmt逆轉(zhuǎn)NAFLD的分子機制假設圖Figure 4.Molecular Mechanism Hypothesis of Exercise Regulates UPRmt and Reverses NAFLD