小麥TaAlaAT基因的克隆及鎘脅迫下表達分析

于永昂， 張夏冰， 張 蕾， 睢曉湉

(1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003； 2.河南科技學(xué)院現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

近年來，我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大調(diào)整，為了進一步提高我國糧食作物的產(chǎn)量，在田間生產(chǎn)過程中化肥和農(nóng)藥的使用越來越多，導(dǎo)致我國自然環(huán)境中重金屬污染越來越嚴重。最新的研究結(jié)果表明，在眾多重金屬污染中，鎘(Cd)污染占首位，并且其已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為食物污染物。Cd是生命非必需元素，容易被植物吸收和積累后通過食物鏈最終進入人體，誘發(fā)神經(jīng)痛、內(nèi)分泌失調(diào)等多種病征，對人的身體健康造成極大危害。因此，Cd污染問題已經(jīng)成為我國土壤生態(tài)安全和制約農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素。降低土壤Cd污染含量和緩解Cd對植物的毒害作用，已經(jīng)成為當前研究的一個熱點問題。目前，許多研究者已經(jīng)在玉米、大豆、水稻、煙草、花生等多種糧食作物和經(jīng)濟作物中開展了Cd對農(nóng)作物質(zhì)量影響的相關(guān)研究，并取得了一定成果。然而，與水稻等植物相比，小麥Cd污染相關(guān)研究還較少，尤其是關(guān)于其對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運和積累的機制還不十分清楚。因此，深入研究小麥的耐鎘機制，進一步創(chuàng)制耐Cd或籽粒低Cd積累小麥新種質(zhì)用于改良我國小麥的抗鎘水平及糧食安全都有著非常重要的現(xiàn)實意義。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AlaAT)別稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，是植物碳氮代謝過程中的重要酶類，能夠催化丙氨酸、α-酮戊二酸形成丙酮酸、谷氨酸?；蛟谥参镏心軌騾⑴c光呼吸等生理代謝途徑及抗逆性反應(yīng)等。Son等在研究黍稷葉肉細胞、維管束鞘細胞時發(fā)現(xiàn)，其細胞的細胞質(zhì)中能夠檢測到AlaAT活性，因此他們認為AlaAT在黍稷細胞中可能具有丙酮酸轉(zhuǎn)運的功能。在小麥中的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，從小麥黃化苗中能夠檢測到AlaAT，將黃化苗恢復(fù)在光照條件下培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其酶活性顯著增加，表明恢復(fù)光照后，在小麥植株轉(zhuǎn)綠過程中該酶發(fā)揮了重要作用。在低氧環(huán)境下，擬南芥基因的表達量顯著增高，而水稻中的基因也能夠響應(yīng)低氧脅迫。茶樹基因能夠響應(yīng)高溫、低溫、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)等脅迫。以上研究結(jié)果表明，基因能夠在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用，深入研究該基因功能對于培育抗逆作物品種具有非常重要的意義。

本研究采用mRNA差異顯示技術(shù)(differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)和 RT-PCR 技術(shù)對小麥的基因進行克隆，利用qRT-PCR技術(shù)分析該基因在不同組織中及鎘脅迫處理后的表達水平，以期為全面解析基因在小麥中的功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本試驗于2020年1—10月在河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)中心開展，供試小麥品種為百農(nóng)矮抗58。將小麥種子用無菌水沖洗3～5次后鋪于培養(yǎng)皿中，于溫度25 ℃、光—暗周期16 h—8 h的條件下培養(yǎng)14 d。選取生長一致的小麥幼苗，用1.0 mmol/L CdCl處理2、4、6、8、12 h后取樣，以用純凈水處理的小麥作為對照，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中備用，以上每個處理均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DDRT-PCR分析和差異片段回收 以錨定引物H-T11A作為反轉(zhuǎn)錄引物，將鎘脅迫組和對照組的小麥葉片用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的試劑盒提取總RNA，參照PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa)使用說明書合成第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板，用H-T11A錨定引物與8個隨機引物(SP1～SP8，序列見表1)組合的8對引物進行RT-PCR擴增。通過電泳檢測挑選差異性條帶后，經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收后送至金斯瑞生物科技股份有限公司測序。

表1 用于小麥DDRT-PCR的引物序列

1.2.2 差異基因序列擴增與生物信息學(xué)分析 將獲得的測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)1個與差異基因序列高度同源的基因序列(GenBank登錄號：AK455865)，對該序列進行分析后發(fā)現(xiàn)其含有1個完整的開放閱讀框(ORF)，編碼谷丙氨酸轉(zhuǎn)移酶蛋白，因此將該基因命名為。根據(jù)所獲得的基因序列設(shè)計特異性引物：-F，5′-A C A C C C A C C T T T C C C C T C-3′；-R，5′-T A T C A A G C A T A G C A A C C A-3′。以小麥葉片cDNA為模板進行PCR擴增，用NCBI網(wǎng)站的相關(guān)程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對獲得的核苷酸、蛋白質(zhì)序列進行BLAST比對搜索；用MEGA 6.0構(gòu)建進化樹。

1.2.3 Cd脅迫下基因的表達分析 根據(jù)測序所得序列設(shè)計特異性定量引物：qRT--F，5′-G A G A G G G A C G G G A T T T T G-3′；qRT--R，5′-G C T T C A C T C A G G C A T T G G-3′。以小麥的基因作為內(nèi)參基因(-F：5′-C T T G T A T G C C A G C G G T C G A A C A-3′；-R：5′-C T C A T A A T C A A G G G C C A C G T A-3′)。qRT-PCR反應(yīng)所用儀器為Roche的LightCycler 480，PCR反應(yīng)所用酶為TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。用2-ΔΔ法分析試驗數(shù)據(jù)。同一處理所用的樣品數(shù)為3個，每次對同一樣品進行3次重復(fù)試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥差異片段的分離與回收

采用1個錨定引物和8個隨機引物，共8對引物進行DDRT-PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)Cd處理后獲得1個表達量增強的條帶(圖1)，推測該PCR產(chǎn)物可能響應(yīng)了小麥的Cd脅迫處理，因此將該條帶進行切膠回收純化。

2.2 TaAlaAT基因全長的獲得及序列分析

差異表達片段測序結(jié)果表明，該片段大小為274 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLASTx對比發(fā)現(xiàn)，該片段與基因的相似性很高，根據(jù)篩選獲得基因序列設(shè)計特異性引物，以小麥葉片cDNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴展得到1個1 500 bp左右的條帶(圖2)。測序結(jié)果表明，該片段全長 1 628 bp，包含1個長度為1 440 bp的完整ORF，編碼479個氨基酸(圖3)。蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的相對分子量為53.41 ku，理論等電點為6.97，化學(xué)方程式為CHNOS。不穩(wěn)定指數(shù)為41.84，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為85.91，總平均疏水性(GRAVY)為-0.220，為親水性蛋白。用在線工具SignalP 3.0、TMHMM分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的N端不含信號序列，有跨膜結(jié)構(gòu)域(位置為109～131 bp)。用在線工具SOPMA對其進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由36.12% α-螺旋(alpha helix)、31.32%無規(guī)則卷曲(random coil)、21.50%延伸鏈(extended strand)和11.06% β-轉(zhuǎn)角(beta turn)組成(圖4)。對小麥基因保守域的預(yù)測結(jié)果顯示，第83～464位含有1個典型的AAT-like保守結(jié)構(gòu)域(圖5-A)，表明TaAlaAT屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族。

此外，多重序列比對結(jié)果表明，小麥TaAlaAT與擬南芥(NP_173173)、油菜(XP_013641560)、煙草(XP_016466182)、水稻(AAO84040)和玉米(AAC62456)的一致性為70.23%(圖5-B)。用MEGA 6.0構(gòu)建進化樹的結(jié)果顯示，TaAlaAT與水稻OsAlaAT的親緣關(guān)系最近(圖6)。

2.3 TaAlaAT基因表達模式分析

為了進一步研究基因的時空表達模式、同組織部位的表達模式，采用qRT-PCR方法分析基因在小麥根、莖、葉、 雄蕊和雌蕊中的表達模式。由圖7可以看出，該基因在小麥不同組織中都有一定程度的表達，但表達量不同，表達量由高到低排序為葉>莖>根>雄蕊>雌蕊。在鎘脅迫下對基因進行分析發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間的延長，基因的表達量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在處理4 h時基因的表達量最高，隨后逐漸降低，在處理12 h時恢復(fù)至對照水平(圖8)。由此推測，基因在小麥響應(yīng)鎘脅迫中起著一定作用。

3 結(jié)論與討論

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一種以磷酸吡哆醛為輔酶的轉(zhuǎn)氨酶，其催化的可逆反應(yīng)中可用的底物包括在碳代謝中起關(guān)鍵作用的戊二酸、丙酮酸以及參與氮同化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的谷氨酸，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶在碳氮代謝過程中起著關(guān)鍵作用，能夠幫助植物抵御外界脅迫。本研究采用DDRT-PCR技術(shù)和RT-PCR技術(shù)成功獲得了小麥基因，對由該基因推導(dǎo)的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族。多重序列比對結(jié)果表明，基因編碼的氨基酸序列與其他植物AlaAT蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有很高的相似度，包含磷酸吡哆醛倚賴轉(zhuǎn)移酶Ⅰ、Ⅱ和氨基酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ、Ⅱ等結(jié)構(gòu)及C-末端過氧化物酶體靶標信號位點PTS。組織表達模式分析發(fā)現(xiàn)，小麥基因的表達具有組織特異性，在小麥葉片中的表達量最高，其次是在小麥莖、根中，在雌蕊、雄蕊中的表達量最低。qRT-PCR結(jié)果表明，基因表達量在鎘脅迫后呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，說明基因能夠響應(yīng)鎘脅迫處理，推測其能夠參與植物鎘脅迫過程。非生物脅迫會導(dǎo)致植物在氮化物合成過程中積累過多的氨，而氨含量的過多積累會造成細胞膜損傷，進而影響到植物的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫后，水稻葉片中游離氨基酸的含量會增加，而游離氨基酸在一定條件下可以維持植物細胞的正常水勢，并在一定程度上降低細胞的毒性效應(yīng)。另外，茶葉基因能夠響應(yīng)高溫脅迫。在小黑楊中過表達基因能夠提高轉(zhuǎn)基因株系谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活性，1 mmol/L 硝態(tài)氮能夠促進轉(zhuǎn)基因植株根、葉片中基因的表達。同時，與氮代謝相關(guān)的、、、和等基因的表達量增加。在甘蔗中過表達大麥基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在低氮條件下的氮素利用率。在缺氧、低氮和弱光條件下，小麥幼苗地上部分的丙氨酸及其同系物谷氨酸的含量高于地下部分，表現(xiàn)出較高的耐性。因此，研究氮素含量與植物耐逆性之間的關(guān)系對于研究植物抗逆性機制具有重要意義。

目前，對小麥氮代謝的研究主要集中在不同氮代謝關(guān)鍵酶活性與氮吸收、積累等方面，對小麥谷丙氨酸轉(zhuǎn)移酶基因的研究還較少。因此，深入研究小麥基因的分子作用機制，對于揭示其在小麥碳氮代謝及抵御脅迫中的作用和機制有重要的理論意義。