李超 王建欣 朱秀芳

難治性癲癇約占癲癇病例的10%，具有治療困難，病情易反復(fù)等特點(diǎn)[1]。治療仍以藥物治療為主，托吡酯、左乙拉西坦(LEV)與卡馬西平(CBZ)的聯(lián)合治療顯示出明顯的療效，減少了癲癇發(fā)作頻率并具有良好的安全性，通常是難治性癲癇一個(gè)有用的臨床選擇[2]。然而，這些抗癲癇藥物的使用具有患者個(gè)體差異大、安全性低和毒性高等特點(diǎn)。因此，監(jiān)測(cè)藥物的血藥濃度是臨床實(shí)踐中調(diào)整劑量、減少不良反應(yīng)和確保療效的一個(gè)重要指示。本研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上[3-14]，建立了一種基于HPLC-MS/MS的方法，用于快速、準(zhǔn)確地測(cè)定難治性癲癇患者中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器 美國(guó)AB SCIEX公司電噴霧離子源(ESI源)4000Q TRAP型質(zhì)譜儀)；含液相輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和日本日本島津公司的HPLC-30A液相色譜系統(tǒng)；美國(guó)SCILOGEX公司D3024型臺(tái)式高速微量離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 托吡酯、左乙拉西坦及卡馬西平對(duì)照品，均由成都德斯特生物技術(shù)有限公司提供，含量均≥98%，批號(hào)分別為：DST181230-023、DST190223-028和DST190228-318；；內(nèi)標(biāo)咖啡因內(nèi)標(biāo)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.9%，批號(hào)：171215-2010?？瞻籽獫{取自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱為Phenomenex Kinetex XB-C18，(2.6 μm，50×3 mm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-水(含2%的甲酸)(B)，按照以下梯度進(jìn)行洗脫(0～2 min，30∶70→80∶20；2～4 min，80∶20；4～5 min，80∶20→30∶70)；流速為0.4 ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5 μl。

1.3.2 質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式進(jìn)行檢測(cè)，MRM模式進(jìn)行掃描；ESI源電壓為5 500 V，ESI源溫度為 600℃；氣簾氣壓力為20 psi，輔助氣壓力為55 psi，霧化氣壓力為55 psi，碰撞氣壓力為High；毛細(xì)管入口和出口的電壓都為10 V。見表1。

表1 托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的質(zhì)譜碎片及參數(shù)

1.3.3 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液配制

1.3.3.1 對(duì)照品溶液配制：精密稱定托吡酯對(duì)照品5.00 mg，用甲醇定容為1 mg/ml的托吡酯儲(chǔ)備液。甲醇稀釋該托吡酯儲(chǔ)備液成濃度分別為5、50、150 μg/ml的托吡酯系列質(zhì)控樣品以及濃度分別為1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的托吡酯系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；以上述同法配置濃度分別為50、200、500 μg/ml和濃度分別為0、50、100、200、300、500、700 μg/ml的左乙拉西坦系列質(zhì)控樣品和系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；濃度為5、50、150 μg/ml和濃度分別為1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的卡馬西平系列質(zhì)控樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱定咖啡因?qū)φ掌?.00 mg，用甲醇將對(duì)照品定容為1 mg/ml的咖啡因內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。后用甲醇將其稀釋成1 μg/ml的咖啡因內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.4 血漿樣品處理：在100 μl空白血漿中加入10 μl 內(nèi)標(biāo)溶液及30 μl甲醇，渦旋混勻30 s后，加入260 μl甲醇，再渦旋混勻60 s，以12 000 r/min于室溫下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液取5 μl進(jìn)樣分析。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 專屬性：以給藥60 min后患者血漿、對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品+空白血漿和空白血漿的各6個(gè)樣品分別進(jìn)樣，測(cè)定各樣品的色譜圖。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限：在100 μl空白血漿中分別加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平系列標(biāo)準(zhǔn)曲線以及內(nèi)標(biāo)溶液，配成濃度為0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的托吡酯系列血漿樣品，1、5、10、20、30、50、70 μg/ml的左乙拉西坦系列血漿樣品， 0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的卡馬西平系列血漿樣品，以1/χ2為權(quán)重，將y/x進(jìn)行進(jìn)行回歸分析，其中y=待測(cè)物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，x為待測(cè)物的濃度。

1.3.5.3 準(zhǔn)確度及精密度：于100 μl空白血漿中，分別加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平系列質(zhì)控樣品溶液以及內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)控樣品溶液，配成濃度為0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的系列血漿質(zhì)控樣品溶液各6份，連續(xù)3 d進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.3.5.4 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)：取不同濃度分別為0.5、5、15 μg/ml的托吡酯，濃度為5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，濃度為0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的血漿質(zhì)控樣品溶液各6份，得峰面積A；另取100 μl 的空白血漿18份，均加入260 μl甲醇，渦旋混勻60 s， 12 000 r/min室溫下離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，將相應(yīng)濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因溶液加入續(xù)濾液中，渦旋60 s后進(jìn)樣分析，得峰面積B。提取回收率=峰面積A/峰面積B。以100 μl空白血漿100 μl，得空白基質(zhì)，加入10 μl不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平質(zhì)控樣品溶液以及內(nèi)標(biāo)溶液，配成濃度為0.5、5、15 μg/ml托吡酯基質(zhì)考察樣品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦基質(zhì)考察樣品，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的基質(zhì)考察樣品各6份，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積C；于純水中加入不同濃度的托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平質(zhì)控樣品及內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)控樣品，配成濃度分別為0.5、5、15 μg/ml托吡酯質(zhì)控樣品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦質(zhì)控樣品， 0.5、5、15 μg/ml卡馬西平的質(zhì)控樣品各6份，得相應(yīng)峰面積D。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=峰面積C/峰面積D×100%。

1.3.5.5 穩(wěn)定性：取24份血漿質(zhì)控樣品溶液，分別含濃度分為0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡馬西平，考察其在室溫6 h放置、處理后3 d放置、3次反復(fù)凍融、20 d-20℃凍存的穩(wěn)定性。

1.3.6 臨床應(yīng)用

1.3.6.1 受試者的選擇：本研究方案已經(jīng)過河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有納入的患者均符合《神經(jīng)外科與癲癇》中難治性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；患者正在繼續(xù)接受托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的口服治療；左乙拉西坦維持劑量為30 mg·kg-1·d-1；托吡酯維持劑量為4 mg·kg-1·d-1；卡馬西平維持劑量為15～20 mg·kg-1·d-1；已獲得患者和家屬的知情同意；并且未同時(shí)聯(lián)用其他抗癲癇藥物；排除標(biāo)準(zhǔn)：非癲癇性精神疾病的患者；孕婦和哺乳期女性；嚴(yán)重肝腎功能損害患者；易過敏體質(zhì)者，對(duì)托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平存在禁忌證者。

1.3.6.2 受試者血樣采集：這些受試者按維持劑量口服3種藥物1 d以上達(dá)穩(wěn)態(tài)濃度。在早晨用藥前0.5 h取前外側(cè)靜脈中抽取5 ml血液，于肝素鈉管中，以5 000 r/min離心10 min，取上層血漿并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中以備測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 根據(jù)以上操作得到托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的保留時(shí)間分別為2.81、0.88、3.38 和1.19。其中內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)對(duì)托吡酯、左乙拉西坦、卡馬西平和咖啡因的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，有良好的專屬性。見圖1。

圖1 托吡酯(Ⅰ)、左乙拉西坦(Ⅱ)、卡馬西平(Ⅲ)和咖啡因(Ⅳ)的色譜圖；A 空白血漿；B 空白血漿+托吡酯+左乙拉西坦+卡馬西平+內(nèi)標(biāo)；C 血漿樣品+內(nèi)標(biāo)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 托吡酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=261X152(r=0.9638)，在0.1～20 μg/ml線性范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，定量下限為0.01 μg/ml；左乙拉西坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.36×103x+3.57×104(r=0.9959)，在1～70 μg/ml線性范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，定量下限為0.1 μg/ml；卡馬西平的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.31×104x+2.55×104(r=0.9215)，在0.1～20 μg/ml線性范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，定量下限為0.01 μg/ml。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度 3種藥物的準(zhǔn)確度均在±15%范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差均在15%以下，符合生物樣品定量分析的要求[15]。見表2。

表2 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的準(zhǔn)確度和精密度 n=6

2.4 提取和基質(zhì)效應(yīng) 測(cè)得在3個(gè)濃度的托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平回收率分別為為91.68%～106.45%、103.52%～107.24%和93.57%～104.31%，其內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子分別為92.52%～103.87%(RSD<15%，n=6)、91.79%～104.25%(RSD<15%，n=6)和94.23%～104.48%(RSD<15%，n=6)；咖啡因回收率為92.34%，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為98.61%(RSD<15%)。該提取物相關(guān)參數(shù)符合生物樣品定量的相關(guān)要求[15]，且樣品測(cè)量不受基質(zhì)的影響。見表3。

表3 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) n=6

2.5 穩(wěn)定性 血漿樣品溶液在室溫6 h放置、處理后3 d放置、3次反復(fù)凍融、20 d -20℃凍存的條件下均穩(wěn)定，RSD值均小于15%。見表4。

表4 血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平的穩(wěn)定性 n=6

2.6 臨床應(yīng)用 共納入32例難治性癲癇患者，其中男14例，女18例；年齡20～48歲，平均(34.6±7.65)歲；體重45～67 kg平均(54.0±6.02)kg；身高172～180 cm,平均(175.3±2.29)cm。經(jīng)測(cè)定32例難治性癲癇患者體內(nèi)托吡酯血藥濃度為3.34～12.56 mg/ml，平均(7.92±1.82)μg/ml；左乙拉西坦的血藥濃度為15.62～48.25 kg/ml，平均(30.34±8.13)μg/ml；卡馬西平的血藥濃度為3.24～15.29 mg/ml，平均(7.74±2.44)μg/ml。

3 討論

目前測(cè)定血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平濃度的方法有傳統(tǒng)的HPLC法及HPLC-MS/MS法。傳統(tǒng)的HPLC法靈敏度相對(duì)較低、專屬性較差，而單一成分的檢測(cè)方法效率不高，不適用于臨床大樣本的血藥濃度監(jiān)測(cè)。在這項(xiàng)研究中，開發(fā)了一種HPLC-MS/MS方法，可以同時(shí)測(cè)量血漿中3種藥物的濃度，從而減少分析時(shí)間，提高分析方法的靈敏度和特異性。本研究將甲醇作為蛋白沉淀劑，在血漿樣品處理上，與液-液萃取法相比，本法提取回收率較高，此外甲醇沉淀法更經(jīng)濟(jì)環(huán)保、便于操作。

本研究結(jié)果顯示，32例難治性癲癇患者臨床常規(guī)劑量給予托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平達(dá)穩(wěn)態(tài)時(shí)，測(cè)得托吡酯血藥濃度為3.34～12.56 μg/ml，與其臨床推薦血藥濃度5～20 μg/ml相比[16,17]，有2例患者低于該濃度范圍；測(cè)得左乙拉西坦血藥濃度為15.62～48.25 μg/ml，與其臨床推薦有效血藥濃度12～46 μg/ml相比[18,19]，有1例患者高于該濃度范圍；測(cè)得卡馬西平血藥濃度為3.24～15.29 μg/ml，與其臨床推薦有效血藥濃度4～12 μg/ml相比[20,21]，有1例患者高于該濃度范圍，1例患者低于該濃度范圍。由此得出這3種藥物在不同人群中血藥濃度差別大，存在一定的個(gè)體差異性。臨床使用時(shí)需進(jìn)行TDM監(jiān)測(cè)，以便制定個(gè)體化給藥方案，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，本研究建立的同時(shí)測(cè)定血漿中托吡酯、左乙拉西坦和卡馬西平濃度的HPLC-MS/MS法，適用于臨床上監(jiān)測(cè)難治性癲癇患者體內(nèi)的血藥濃度，從而用于指導(dǎo)患者調(diào)整給藥方案，提高用藥的合理性，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。