不同提取方法下蕪菁功能成分及抗氧化活性測定

于翠翠，張文會，陳 鋒

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000）

西藏蕪菁（Brassica rapa） 是十字花科（Cruciferae） 蕓苔屬 （Brassica） 二年生草本植物[1]，是藏區(qū)特有的高寒低氧的惡劣環(huán)境下孕育出來的藥、食、飼三用植物[2]。藏醫(yī)學(xué)名著《四部醫(yī)典》記載，蕪菁具有味甘性溫、清熱解毒、滋補(bǔ)、增氧的功能[3]。藏醫(yī)使用時常將其根洗凈、切片、煎煮濃縮成膏狀入藥作為抗缺氧的食物?！端拇ㄊ〔厮幉臉?biāo)準(zhǔn)》記載蕪菁塊莖中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、酸類、礦物質(zhì)、維生素等[4]?，F(xiàn)代研究表明，蕪菁功能性組分主要含有多糖類[5]、皂苷類[6]、黃酮[7]、三萜類[8]及有機(jī)酸等；具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗疲勞及耐缺氧等功效，為開發(fā)蕪菁保健食品提供了理論依據(jù)[9]。主要探究3 種提取方法下蕪菁中總黃酮、總皂苷及三萜類物質(zhì)含量變化及其抗氧化能力，為后續(xù)蕪菁開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

蕪菁粉，采摘西藏自治區(qū)拉薩市；薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供；總抗氧化能力（T-AOC） 試劑盒，南京建成生物研究所提供；無水乙醇、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶；亞硝酸鈉、氯化鋁、香草醛、高氯酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，常州國語儀器制造有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，北京凱奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

芫菁根經(jīng)清洗、除雜后切片烘干，粉碎過80 目篩，按照下述方法進(jìn)行提取。

1.3.2 提取方法

①水提法：準(zhǔn)確稱取蕪菁干粉5 g，按1∶30 料液比加入純水，在50 ℃條件下提取5 h；②超聲-醇提法：準(zhǔn)確稱取蕪菁干粉5 g，按1∶30 料液比加入70%乙醇，在超聲400 W 條件下65 ℃提取30 min；③酶法：準(zhǔn)確稱取蕪菁干粉5 g，按1∶30 液料比加入純水，加入由纖維素酶、果膠酶（質(zhì)量比2∶1），酶添加量為2%，調(diào)節(jié)pH 值為7 后在50 ℃條件下提取3 h；全部提取液經(jīng)過濾紙除雜后備用。

1.3.3 蕪菁提取液活性物質(zhì)含量測定

（1） 總黃酮含量測定[10]。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加乙醇定容至刻度線，得質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 于 10 mL 離心管中，加入5%亞硝酸鈉0.15 mL 混勻放置6 min，加入10%硝酸鋁0.15 mL 混勻放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉2 mL，用乙醇定容至5 mL，在波長510 nm下測定吸光度（OD51）0[11]。以蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），以O(shè)D510為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=6.308 6X+0.006 3，R2=0.997 3；標(biāo)準(zhǔn)曲線在蘆丁質(zhì)量為0.05～0.25 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取2 mL 蕪菁提取液，取按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定黃酮類質(zhì)量濃度，計(jì)算黃酮質(zhì)量濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算黃酮得率，重復(fù)3 次計(jì)算平均值。

式中：C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)液的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——反應(yīng)液體積；

V2——提取液總體積，mL；

V1——待測液移取的體積，mL；

M——稱取的蕪菁質(zhì)量，g。

（2） 總皂苷質(zhì)量濃度測定[12]。準(zhǔn)確稱取薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，得質(zhì)量濃度0.4 mg/mL 的薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL于1.5 mL 離心管中，水浴65 ℃揮干溶劑后；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛冰醋酸（新鮮配制） 0.04 mL 和高氯酸0.16 mL，于65 ℃水浴中加熱15 min，冷卻后加冰醋酸0.5 mL，于波長540 nm處測定吸光度（OD54）0[11]。以薯蕷皂苷質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），以O(shè)D540為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=7.759 1X，R2=0.997 5；標(biāo)準(zhǔn)曲線在薯蕷皂苷質(zhì)量為0.008～0.040 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取蕪菁提取液1 mL用無水乙醇稀釋至15 mL，取稀釋后液體0.1 mL 取按照薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定皂苷含量，計(jì)算皂苷得率。重復(fù)3 次計(jì)算平均值。

式中：C——芫根總皂苷質(zhì)量，g；

M——原料質(zhì)量，g；

N——提取液稀釋倍數(shù)。

取蕪菁提取液1 mL 用無水乙醇定容至5 mL，取定容后液體0.2 mL 取按照齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定三萜類含量，計(jì)算三萜類得率。重復(fù)3 次計(jì)算平均值。

式中：C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)液的三萜質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——反應(yīng)液體積；

V2——提取液總體積，mL；

V1——待測液移取的體積，mL；

M——稱取的蕪菁質(zhì)量，g。

1.3.4 蕪菁提取物體外抗氧化活性試驗(yàn)

在國際社會不可再生能源日趨枯竭和節(jié)能環(huán)保理念愈發(fā)深入人心的當(dāng)下，畢總認(rèn)為在中國市場中雖然“油改電、鋰電化”已推行了一段時間，但進(jìn)程仍需加快和加深，在叉車和電池技術(shù)上有著自己獨(dú)特優(yōu)勢的比亞迪叉車，仍繼續(xù)前進(jìn)，為“油改電、鋰電化”做出貢獻(xiàn)。

（1） DPPH 自由基清除能力測定[13]。用無水乙醇配制0.1 mml/L DPPH 溶液，樣品組：取蕪菁提取液1 mL 分別加入DPPH 溶液2 mL，為A1；空白組：取DPPH 溶液2 mL 加入純水1 mL，為A0；干擾組：取不同濃度蕪菁提取液1 mL 分別加入純水2 mL，為A2；搖勻后在室溫條件下避光靜置15 min，在波長517 nm 處檢測吸光度，計(jì)算DPPH 自由基清除率。

（2） 總抗氧化能力測定。采用南京建成生物有限公司試劑盒，按照其方法取提取液0.1 mL 進(jìn)行總抗氧化能力的測定，并按照公式進(jìn)行總抗氧能力的計(jì)算。

式中：A0——對照OD 值；

A1——測定OD 值。

1.3.5 羥自由基清除能力的測定[14]

在比色管中依次加入濃度為6 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液2 mL，濃度為6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL，濃度為6 mmo/L 過氧化氫溶液2 mL 后搖勻，樣品組加入1 mL 提取液，為A1；空白組加入1 mL 純水代替提取液，為A0；干擾組以2 mL 純水代替過氧化氫，為A2。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種提取方法下活性物質(zhì)含量測定結(jié)果

3 種提取方法下3 種活性物質(zhì)含量見表1。

表1 3 種提取方法下3 種活性物質(zhì)含量/ %

由表1 可知，超聲- 醇提法下總黃酮含量最高為0.173%，與水法和酶法提取總黃酮含量對比呈現(xiàn)顯著性增加；3 種提取方法下蕪菁總皂苷含量均存在差異顯著性，酶法提取總皂苷含量最高為14.96%，其次超聲- 醇提法下蕪菁總皂苷含量為11.83%，水提法總皂苷含量最小，為8.93%；3 種提取方法下酶法提取三萜含量最高為7.45%，超聲- 醇法提取測定總皂苷和三萜含量為6.05%，這2 種提取方法較水法提取顯著性增加。

2.2 3 種提取方法下體外抗氧化活性測定

2.2.1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力測定

不同提取方法下DPPH 自由基清除能力見圖1。

由圖1 可知，3 種提取方法下提取液對DPPH 自由基清除率均大于90%，水提法提取液對DPPH 自由基清除率最小為90.28%，超聲醇提法、酶法提取液對DPPH 自由基清除率分別為94.74%，95.65%，其中酶法提取液對DPPH 自由基清除率最高，3 種提取方法下DPPH 自由基清除率不存在顯著性差異。

圖1 不同提取方法下DPPH 自由基清除能力

2.2.2 不同提取方法羥基自由基清除能力測定

不同提取方法下羥基自由基清除能力見圖2。

圖2 不同提取方法下羥基自由基清除能力

由圖2 可知，超聲- 醇法提取液對羥基自由基清除率最小，為60.37%，水提法、酶法提取液對羥基自由基清除率分別為78.72%，90.40%，水提與醇提2 種方法均與超聲- 醇法提取液對羥基自由基清除率存在顯著性差異。

2.2.3 不同提取方法下總抗氧化能力測定

不同提取方法下總抗氧化能力見圖3。

圖3 不同提取方法下總抗氧化能力

由圖3 可知，超聲- 醇提法提取液總抗氧化能力最高，為11.59 U/mL；水提法、酶法提取液總抗氧化能力分別為7.4 U/mL，9.04 U/mL，超聲- 醇提法與水提法總抗氧化能力存在顯著性差異，與酶提法總抗氧化能力不存在顯著差異。

3 結(jié)論

超聲- 醇提法總黃酮得率顯著性高于其他2 種提取方法，酶法提取測定總皂苷和三萜得率均為最高，且顯著高于水法提??；酶法提取對DPPH 自由基清除和羥基自由基清除能力上最強(qiáng)，在對羥基自由基清除能力上與其他2 種提取方法存在顯著性差異，在總抗氧化能力上超聲- 醇提法顯著高于其他2 種提取方法；綜上所述，酶法提取可作為提取蕪菁較為方便的方法。