黃越，方崇鍇，聶多銳，藍(lán)清霞，李躍軍，黃學(xué)武

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院，湖南 株洲 412000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

胃惡性腫瘤(gastric cancer，GC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其5年生存率極低，僅為29%[1]。胃癌患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，很多已到晚期，失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。胃癌患者在化療的過(guò)程中，生活質(zhì)量降低，而且長(zhǎng)期使用化療藥會(huì)讓腫瘤患者產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，比如有一些會(huì)出現(xiàn)骨髓抑制的現(xiàn)象，多次化療可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性，最后療效無(wú)法提升甚至療效不佳[2]。中醫(yī)藥治療講究整體觀念和辨證論治，中藥可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，能緩解藥物的諸多不良反應(yīng)，達(dá)到減毒增效的目的，有助于化療的順利進(jìn)行，在防治腫瘤過(guò)程中具有不可替代的作用。

黃芪含皂苷、黃芪多糖、黃酮類(lèi)等主要成分，在藥理學(xué)上具有治療應(yīng)激氧化及惡性腫瘤、免疫調(diào)節(jié)保護(hù)等多種作用[3]。莪術(shù)具有破血消積、行氣止痛的作用，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其主要成分有揮發(fā)油、姜黃素類(lèi)、多糖類(lèi)等,能夠抗腫瘤、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)胃腸平滑肌等[4]。補(bǔ)氣健脾，活血化瘀是中醫(yī)常用的抗腫瘤治療法則。黃芪配莪術(shù)是國(guó)醫(yī)大師朱良春教授治療胃病最為常用的藥物組合[5]，黃芪能補(bǔ)五臟之虛，莪術(shù)善于行氣、破瘀、消積。莪術(shù)與黃芪同用，可奏益氣化瘀之功。兩藥相伍，行中有補(bǔ)，補(bǔ)中有行，相得益彰。黃芪和莪術(shù)配伍，也是臨床常用的抗腫瘤組合[6]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠通過(guò)增強(qiáng)胃黏膜防御因子而起到保護(hù)胃黏膜、預(yù)防胃癌前病變的重要作用[7]。莪術(shù)通過(guò)影響細(xì)胞周期、抑制某些通路和多種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖[8]。黃芪和莪術(shù)均有抗癌的作用，但兩者配伍治療胃癌的具體作用機(jī)制未見(jiàn)明確闡述。

中藥治療疾病的過(guò)程中具有作用靶點(diǎn)多、成分多、途徑多等特點(diǎn)，現(xiàn)代藥理學(xué)等研究表明，黃芪和莪術(shù)的有效成分可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑治療相關(guān)疾病[3-4,9]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)理論的基礎(chǔ)上，形成復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)模型，體現(xiàn)藥物、活性成分、靶點(diǎn)、通路、疾病間相互作用的整體性與系統(tǒng)性，從而對(duì)藥物治療疾病的藥理學(xué)機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)[10-11]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，篩選黃芪和莪術(shù)的主要活性成分，研究其治療胃惡性腫瘤的作用機(jī)制，為后續(xù)的相關(guān)研究提供思路。

1 方法

1.1 活性成分的前期準(zhǔn)備

本研究在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索，檢索內(nèi)容為“黃芪”“莪術(shù)”。 藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類(lèi)藥性(drug-likeness，DL)是代表藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)。本研究設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18來(lái)篩選活性成分。

1.2 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)活性成分治療胃癌作用靶點(diǎn)的獲取與收集

通過(guò)TCMSP平臺(tái)查詢(xún)黃芪-莪術(shù)有效成分的靶點(diǎn)信息，把靶點(diǎn)分別輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)，定義種源為人，檢索目標(biāo)蛋白的基因名稱(chēng)。與胃癌有關(guān)的靶點(diǎn)的獲得，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)檢索“gastric cancer”。將“藥物-活性成分” “活性成分-靶點(diǎn)”相互關(guān)系整理成Microsoft Excel文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.0，繪制藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，從中分析參數(shù)，選出兩者的核心作用成分。取兩藥共同靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交叉部分，描繪黃芪-莪術(shù)和胃癌靶點(diǎn)的交集圖。

1.3 繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用圖

把黃芪-莪術(shù)治療胃癌的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)Version 10.5中進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，并使用 Cytoscape 3.7.0軟件繪制PPI圖。

1.4 分子對(duì)接的準(zhǔn)備過(guò)程

首先在PPI圖中選擇度值(degree)前5的靶點(diǎn)作為核心受體蛋白。目標(biāo)蛋白選自RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)，使用Pymol軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水和去原配體，運(yùn)行AutoDock Vina軟件對(duì)受體蛋白加極性氫。從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc.docking.org/)查詢(xún)黃芪-莪術(shù)藥對(duì)關(guān)鍵成分的結(jié)構(gòu)，并保存為mol格式。將活性成分和靶蛋白均轉(zhuǎn)換成pdbqt格式文件。目標(biāo)蛋白與配體對(duì)接結(jié)果以最低結(jié)合能為依據(jù)，使用Pymol軟件進(jìn)行觀察和作圖。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，具體原理是對(duì)接大分子(蛋白質(zhì))和小分子(配體)，兩者結(jié)合程度的大小通過(guò)能量的高低來(lái)表現(xiàn)，通常認(rèn)為能量越低，蛋白質(zhì)與小分子化合物結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定[12]。

1.5 基因本體生物過(guò)程及京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析

將預(yù)測(cè)的靶基因上傳至Omicshare平臺(tái)(http://www.omicshare.com)，限定物種為“human”，基因本體(gene ontology，GO)分析從生物過(guò)程方向進(jìn)行，通路分析選擇京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)，并將其可視化，繪制多靶點(diǎn)、多通路、多作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)活性成分的篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，最終在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到20個(gè)黃芪活性成分，4個(gè)莪術(shù)活性成分，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3-4,9]，將莪術(shù)醇、β-欖香烯、黃芪多糖等已研究出具有抗癌功效的活性成分納入，共26個(gè)活性成分，詳見(jiàn)OSID附表1，表1為最有代表性的10種活性成分。

表1 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)的活性成分

2.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的繪制

通過(guò)TCMSP平臺(tái)搜索得出黃芪的活性成分莎醇-2′,5′-二-O-葡萄糖苷、二氫異黃酮和莪術(shù)的活性成分溫金素、雙去甲氧基姜黃素?zé)o對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息，故予剔除。整理從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息，共有601個(gè)活性成分靶點(diǎn)，其中黃芪554個(gè)，莪術(shù)47個(gè)，去除重疊部分，得到291個(gè)靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入，繪制黃芪-莪術(shù)藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。根據(jù)參數(shù)度值的高低及相關(guān)文獻(xiàn)檢索莪術(shù)醇、β-欖香烯的抗腫瘤機(jī)制[8]，得出作用于胃癌靶點(diǎn)的核心活性成分有槲皮素、山奈酚、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷、莪術(shù)醇、β-欖香烯。

圖1 黃芪-莪術(shù)藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Drug-active-ingredient target network of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma

2.3 黃芪-莪術(shù)治療胃癌的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，得到499個(gè)與胃癌相關(guān)的靶點(diǎn)，取黃芪-莪術(shù)共同作用靶點(diǎn)和胃癌靶點(diǎn)的交集，得到黃芪-莪術(shù)治療胃癌的潛在靶點(diǎn)，共74個(gè)(詳見(jiàn)OSID附表2)。構(gòu)建藥對(duì)與疾病的靶點(diǎn)維恩圖見(jiàn)圖2。整理基因?qū)?yīng)的主要的Uniprot ID，見(jiàn)表2。

圖2 黃芪-莪術(shù)和胃癌靶點(diǎn)的維恩圖Fig.2 Venn diagram of the targets of gastric cancer and Astragali Radix-Curcumae Rhizoma

表2 靶點(diǎn)信息表

2.4 PPI圖的分析結(jié)果

通過(guò)1.3方法得到PPI圖(圖3)。如圖3所示，根據(jù)度值的大小，排名前五的分別是TP53、MYC、CASP3、AKT1、JUN這5個(gè)靶點(diǎn)蛋白，為黃芪-莪術(shù)治療胃癌的主要作用靶點(diǎn)。

圖3 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein-protein interaction network of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma

2.5 分子對(duì)接分析

通過(guò)1.4方法進(jìn)行分子對(duì)接，得到活性化合物與靶蛋白對(duì)接的結(jié)合自由能結(jié)果,主要結(jié)果見(jiàn)表3(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)OSID附表3)?；钚曰衔锱c靶蛋白的結(jié)合能如果是負(fù)值，表示兩者具有結(jié)合能力。結(jié)合活性度越高，負(fù)值的絕對(duì)值就越高，即結(jié)合能力越好。根據(jù)表3的結(jié)果，得出圖4(a)～(f)，即TP53與槲皮素的對(duì)接、MYC與槲皮素的對(duì)接、CASP3與槲皮素和莪術(shù)醇的對(duì)接、AKT1與槲皮素的對(duì)接、JUN與山奈酚的對(duì)接為靶蛋白與活性化合物結(jié)合最好的組合，這說(shuō)明黃芪-莪術(shù)藥對(duì)的活性成分對(duì)主要核心靶點(diǎn)蛋白有調(diào)控作用。

表3 核心靶點(diǎn)蛋白與活性化合物的對(duì)接結(jié)果

圖4 核心靶點(diǎn)蛋白與活性化合物的最佳對(duì)接結(jié)果 Fig.4 Docking results of target proteins with active compounds showing the best binding

2.6 GO生物過(guò)程及KEGG通路富集分析結(jié)果

通過(guò)1.5方法進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖5～6所示。GO生物功能富集分析(圖5)結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)凋亡信號(hào)通路、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物等起作用。從KEGG通路富集分析中，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)主要富集在癌癥, 癌癥中的蛋白聚糖、PI3K-Akt、MAPK、Rap1、TNF、FoxO等信號(hào)通路上[13]，進(jìn)一步獲得如圖6所示的KEGG通路富集分析。

圖5 GO生物功能富集分析Fig.5 Gene ontology pathway enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis

2.7 疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

為了使黃芪-莪術(shù)治療胃惡性腫瘤的機(jī)制更加直觀可視化，通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件，把以上得到的治療胃惡性腫瘤的關(guān)鍵活性成分、靶點(diǎn)和相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行整理，構(gòu)建多靶點(diǎn)、多通路、多作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。圖中共有節(jié)點(diǎn)102個(gè)，邊線516條。綠色三角形代表胃癌，藍(lán)色圓形代表黃芪、莪術(shù)，橙色V形代表藥物活性成分，黃色正方形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，淡橙色菱形節(jié)點(diǎn)代表黃芪-莪術(shù)治療胃癌可能參與的主要信號(hào)通路。這一網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

注：綠色三角形代表胃癌，藍(lán)色圓形代表黃芪、莪術(shù)，橙色V形代表藥物活性成分，黃色正方形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，淡橙色菱形節(jié)點(diǎn)代表黃芪-莪術(shù)治療胃癌可能參與的主要信號(hào)通路。圖7 黃芪-莪術(shù)藥對(duì)多靶點(diǎn)、多通路、多作用網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Multitarget, multichannel, and multifunction network of Astragali Radix-Curcumae Rhizoma

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的形成與氣滯、痰濕、瘀血、毒邪等有關(guān)，常用中醫(yī)治療法則有扶正培本、清熱解毒、活血化瘀、除痰散結(jié)等，黃芪健脾補(bǔ)氣，而莪術(shù)活血化瘀，所以?xún)烧叱Ｅ湮槭褂靡砸鏆饣钛?，是臨床常用抗腫瘤組合[6]。槲皮素、山奈酚、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷屬于黃芪中的黃酮類(lèi)活性成分，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，在聯(lián)合槲皮素化療的研究中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制c-Jun的表達(dá)可增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡[14]。Zhang等[15]研究得出，山柰酚對(duì)人胃癌細(xì)胞的增殖起抑制作用并且能提高胃癌細(xì)胞的自噬能力，其促進(jìn)人胃癌SNU-216細(xì)胞中的miR-181a水平高表達(dá)，導(dǎo)致MAPK/ERK和PI3K通路的表達(dá)受阻。7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷文獻(xiàn)研究較少，但本文發(fā)現(xiàn)其是治療胃癌的核心活性成分之一，值得后續(xù)深入研究。黃芪多糖是黃芪中的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)Bax高表達(dá)，使Bcl-2低表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖及直接殺傷人胃癌細(xì)胞中的MKN45細(xì)胞，還能通過(guò)影響端粒酶活性而抑制腫瘤增長(zhǎng)[16]。莪術(shù)醇通過(guò)阻礙信號(hào)通路和抑制細(xì)胞周期而發(fā)揮抗腫瘤作用，其阻礙JAK2/STAT3、NF-κB及JAK3/STAT5等信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)p38 MAPK信號(hào)通路高表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞增殖的速度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞更多的凋亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能引起人胃癌細(xì)胞多種蛋白質(zhì)差異表達(dá)而發(fā)揮抗癌機(jī)制，又通過(guò)促進(jìn)Bcl-2家族的促細(xì)胞凋亡成員類(lèi)BCL-2蛋白12 和人胃癌細(xì)胞BCL-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(BTF)的高表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞凋亡速度[8]。

本文通過(guò)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖的分析，得出TP53、MYC、CASP3、AKT1、JUN為黃芪-莪術(shù)治療胃癌的主要作用靶點(diǎn)。其中TP53與槲皮素、MYC與槲皮素、CASP3與槲皮素和莪術(shù)醇、AKT1與槲皮素、JUN與山奈酚的對(duì)接為靶蛋白與活性化合物對(duì)接最好的組合，說(shuō)明黃芪-莪術(shù)藥對(duì)的活性成分能對(duì)主要作用靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用，但后續(xù)仍需進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Jiang等[17]證明了TP53突變本身可以導(dǎo)致胃癌和其他癌癥類(lèi)型的免疫活性下降。MYC是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，包括C-myc、N-myc及L-myc，胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和漿膜浸潤(rùn)的速度和程度，在某種程度上與C-myc蛋白的表達(dá)有很大關(guān)系[18]。有研究表明，CASP3通過(guò)影響胃黏膜和胃腫瘤細(xì)胞的凋亡程序而對(duì)胃癌的預(yù)后判斷起相關(guān)作用[19]。AKT1在胃癌組織中出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)的過(guò)程，因此，對(duì)于AKT1的進(jìn)一步研究有利于找到胃癌治療的靶點(diǎn)[20]。JUN能影響細(xì)胞分化及其凋亡過(guò)程，c-JUN通過(guò)磷酸化水平的調(diào)節(jié)，干擾耐藥細(xì)胞周期的凋亡及分化，進(jìn)而對(duì)抗化療藥的多重耐藥，這就為胃癌化療藥耐藥機(jī)制方面的研究提供了有效借鑒[21]。

對(duì)KEGG通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT、MAPK、P53等信號(hào)通路在黃芪-莪術(shù)治療胃惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用，其通過(guò)多種信號(hào)表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖等。如MAPK在人體細(xì)胞中擔(dān)任傳遞信號(hào)的重要角色，其使核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、增殖、分化的作用，發(fā)揮抗炎、抗應(yīng)激、加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用[22]。作為PI3K信號(hào)通路中的核心分子，PI3Ks發(fā)揮調(diào)控人體細(xì)胞分化、增殖的作用。PI3Ks正常以非激活狀態(tài)在人體中，如果發(fā)生突變，PI3Ks大量被激活，進(jìn)而使PI3K-AKT信號(hào)通路高表達(dá)，最終會(huì)造成人體細(xì)胞新陳代謝發(fā)生異常，久之引發(fā)惡性腫瘤病變[23]。研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染是胃惡性腫瘤發(fā)生的高危因素，而攜帶TNF-β基因+252位點(diǎn)A等位基因與Hp感染有相關(guān)聯(lián)系，因此須提高患非賁門(mén)型胃癌的警惕性[24]。

4 結(jié)論

中醫(yī)藥抗癌注重整體觀念，順應(yīng)了腫瘤綜合治療的發(fā)展趨勢(shì)。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法，探討黃芪-莪術(shù)藥對(duì)治療胃癌的分子作用機(jī)制，黃芪-莪術(shù)藥對(duì)治療胃癌的機(jī)制體現(xiàn)了中藥治療多靶點(diǎn)、多通路、多作用的特點(diǎn)，為治療胃癌的臨床研究提供了更多思路和方法。