突破供肝短缺難題： 異種肝移植的發(fā)展與創(chuàng)新

李 霄， 竇科峰

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 肝膽外科， 全軍器官移植研究所， 西安 710032

2021年10月19日和2022年1月7日，美國相繼完成以基因編輯小型豬為供體的異種腎移植和心臟移植的臨床試驗(yàn)并獲得成功[1-2]，自此，以豬為供體的異種移植迅速占據(jù)全球生命科技領(lǐng)域的中心，成為全人類關(guān)注的焦點(diǎn)。近期，美國食品藥物監(jiān)督管理局宣布正在制訂計(jì)劃，即將允許對豬器官移植開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)。TheNewEnglandJournalofMedicine、Nature等權(quán)威期刊近期連續(xù)發(fā)表專家述評[3-4]，一致認(rèn)為異種移植將很快走向臨床實(shí)用，有望徹底解決供體器官短缺的難題。

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，以基因編輯豬為供體的異種肝移植穩(wěn)步進(jìn)展，雖與腎移植、心臟移植和胰島移植相比尚有差距，但目前豬肝移植的最長存活時間也已延長至1個月[5]，為臨床利用異種肝移植作為暴發(fā)性肝功能衰竭的“橋接移植”提供了可能。異種肝移植即將走向臨床實(shí)用。

1 異種肝移植發(fā)展簡史

“異種移植一定會不斷發(fā)展進(jìn)步”，國際肝移植先驅(qū)Thomas Starzl教授曾在討論異種移植時這樣說，“但在這個領(lǐng)域開展的一切都是非常艱難的，我們付出了很多努力。然而這并沒有引起什么確切改變。我甚至并不看好它的前景(我們還有太多的東西需要去探索)，但我認(rèn)為它遲早會完成的……”。

1992年，第一個移植了狒狒肝臟的患者死亡之后(移植肝存活70 d)，Starzl教授等肝移植專家推進(jìn)了一系列狒狒肝臟到人的原位移植計(jì)劃。1993年，Starzl教授團(tuán)隊(duì)又對另1例患者實(shí)施狒狒肝移植，但該患者在術(shù)后26 d因系統(tǒng)性感染而死亡。由于臨床效果不理想，Starzl教授團(tuán)隊(duì)停止了使用狒狒肝臟這一臨床研究計(jì)劃。同年，美國學(xué)者M(jìn)akowka等對1例26歲的自身免疫性肝炎女性患者實(shí)施世界第一例臨床異種豬肝移植。該患者因自身免疫性肝炎導(dǎo)致暴發(fā)性肝昏迷入院，而供體是一頭野生型大白豬。手術(shù)的目的是通過移植豬肝暫時代償肝功能而保證患者存活，直到有人類供體的肝臟可用為止。術(shù)后6 h后見金黃色膽汁不斷流出，患者血清AST、ALT及乳酸等含量持續(xù)減少，提示移植肝在患者體內(nèi)發(fā)揮生理生化功能；同時，受體顱內(nèi)壓持續(xù)下降，凝血功能也逐漸轉(zhuǎn)向正常。然而，在移植后3 h便檢測到了移植物排斥反應(yīng)，并在移植后34 h進(jìn)展為缺血性壞死。最終，患者因不可逆的腦損傷于2 d內(nèi)死亡。

1995年，美國學(xué)者Wakowka等對1例因自身免疫性肝炎導(dǎo)致暴發(fā)性肝功能衰竭的3～4級肝昏迷患者實(shí)施輔助性肝移植，供肝同樣來自野生型大白豬。術(shù)前采用血漿洗脫法和特異性抗體移出法對患者進(jìn)行預(yù)處理，清除了受體循環(huán)血液中90%的抗豬天然抗體，減輕超急性排斥反應(yīng)。術(shù)后采用“環(huán)孢素A+環(huán)磷酰胺+前列環(huán)素E1+硫唑嘌呤”的四聯(lián)免疫抑制治療方案。最終，供肝功能存活20 h，受體存活34 h。尸檢發(fā)現(xiàn)肝臟存在由抗體介導(dǎo)的超急性排斥反應(yīng)所致的大面積梗死，提示受體循環(huán)血液內(nèi)的異種抗體清除后可迅速回升。

在臨床初步嘗試失敗后，異種肝移植研究轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)研究，試圖尋找導(dǎo)致移植失敗的原因及解決方法。2002年和2003年，美國2個研究團(tuán)隊(duì)先后在Science上報(bào)道培育出α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除小型豬(GTKO豬)。隨后全世界開展了一系列以GTKO豬為供體，非人靈長類動物為受體的異種器官移植實(shí)驗(yàn)，取得了重大進(jìn)展。2017年，中美兩國科學(xué)家聯(lián)手采用CRISPR/cas9技術(shù)，將豬體內(nèi)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的62個基因拷貝全部敲除，根除了豬細(xì)胞里面所有的內(nèi)源性病毒活性，并通過核移植克隆技術(shù)成功獲得了第一批37頭無病毒活性的試驗(yàn)豬，為異種移植走向臨床排除了種間交叉感染的風(fēng)險[6]。目前，異種腎移植最長存活499 d[7]，原位心臟移植最長存活199 d[8]，而異種肝移植進(jìn)展顯得較為困難，當(dāng)前最長存活時間為29 d[5]，但已足夠證明豬的肝臟可在人體內(nèi)發(fā)揮一定的代謝功能，能夠?yàn)榧毙愿嗡ソ呋颊咛峁┮欢螘r間的肝功能支持，從而起到“橋接”同種肝移植治療的目的[9]。

2 豬-非人靈長類動物肝移植模型研究進(jìn)展

1968年，Calne等率先利用豬肝開展異種肝移植研究，進(jìn)行了7例野生型豬-狒狒原位肝移植手術(shù)，移植肝和受體最長存活時間3.5 d。隨后，多個研究小組均開展相同的手術(shù)實(shí)驗(yàn)，但存活時間均未超過4 d。隨后，隨著GTKO豬及轉(zhuǎn)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白豬的問世，多個研究小組嘗試使用轉(zhuǎn)基因豬的肝臟以提高存活率。然而，所有的手術(shù)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)豬肝在恢復(fù)血流灌注后，受體將很快出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少，直至發(fā)生致死性凝血功能調(diào)節(jié)障礙，導(dǎo)致多個部位自發(fā)性出血，因而生存時間均<7 d。

起初認(rèn)為在凝血功能調(diào)節(jié)障礙過程中，移植物血管內(nèi)的血栓形成與豬內(nèi)皮細(xì)胞抗凝功能受損有直接關(guān)系，而抗體和補(bǔ)體介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活則促使內(nèi)皮細(xì)胞由抗凝狀態(tài)向促凝狀態(tài)轉(zhuǎn)化。但實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)清除天然抗體并中和受體補(bǔ)體后，并不能完全阻止凝血調(diào)節(jié)功能障礙的發(fā)生。Ekser等[10]和Ezzelarab等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，受體死亡后，在對移植肝標(biāo)本行電鏡檢查時，發(fā)現(xiàn)肝血竇內(nèi)有大量的血小板、炎性細(xì)胞和纖維蛋白沉積，人和非人靈長類動物血小板可能被豬肝移植物識別為“外來物”，并被豬Kupffer細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)吞噬而遭到大量破壞。這種吞噬作用與靈長類動物血小板表面表達(dá)的CD47，與豬Kupffer細(xì)胞、LSEC等表面表達(dá)的信號調(diào)節(jié)蛋白-α(SIGNAL regulatory protein-α，SIRPα)之間的不相容性有關(guān)。有學(xué)者提出將hSIRPα編碼基因轉(zhuǎn)入小型豬，使其LSEC和Kupffer細(xì)胞表達(dá)hSIRPα，以消除對人血小板的吞噬作用。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)hSIRPα與豬CD47的結(jié)合力顯著高于hCD47，因而并不能誘導(dǎo)出抑制性酪氨酸磷酸化信號，沒有得到理想的干預(yù)效果。此外，SIRPα并非只表達(dá)于Kupffer細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞，循環(huán)中的巨噬細(xì)胞也有表達(dá)。因此，循環(huán)中的巨噬細(xì)胞需要與內(nèi)皮細(xì)胞或其他細(xì)胞表面的CD47結(jié)合才能阻止其激活和吞噬，有效的策略可能是同時轉(zhuǎn)入hSIRPα和hCD47[12]。

其他可能介導(dǎo)凝血調(diào)節(jié)功能障礙的因素包括：(1)免疫反應(yīng)導(dǎo)致供肝LSEC激活，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)P-選擇素、E-選擇素、組織因子(tissue factor，TF)等表達(dá)上調(diào)，觸發(fā)外源性凝血途徑。(2)受體血小板和外周血單核細(xì)胞內(nèi)組織因子表達(dá)上調(diào)。(3)微循環(huán)內(nèi)白細(xì)胞-血小板聚集體的形成。(4)豬的TF途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)和人TFPI之間存在結(jié)構(gòu)性差異，導(dǎo)致豬TFPI和人TFPI的功能不兼容，因而豬TFPI不能有效抑制人TF途徑的激活[13]。

考慮到原位肝移植帶來嚴(yán)重的凝血調(diào)節(jié)功能障礙，那么能否將GTKO豬肝作為輔助移植物植入非人靈長類動物體內(nèi)以減輕對受體血小板的破壞？從1968年到2016年，豬到非人靈長類動物肝移植的存活時間從未超過9 d。2013年，筆者團(tuán)隊(duì)在國際上首次嘗試異種脾窩輔助性肝移植研究。實(shí)驗(yàn)過程中，首先切除受體的脾臟，而后將部分GTKO豬的供肝(約120 g)植入脾窩，術(shù)后受體存活時間延長至14 d。尸檢病理學(xué)檢查證實(shí)移植肝內(nèi)存在一定程度的血栓性微血管病，但術(shù)后嚴(yán)重血小板丟失現(xiàn)象并未出現(xiàn)，其計(jì)數(shù)始終維持在50 000/mm3以上，未出現(xiàn)致死性的血小板匱乏[14]。隨后美國麻省總醫(yī)院借鑒該術(shù)式，也完成了全美首例異種異位輔助性肝移植術(shù)，移植肝和受體最長存活15 d[15]，但凝血問題始終沒有得到解決。

針對異種肝移植術(shù)后受體出現(xiàn)致死性血小板減少的問題，美國麻省總院的肝移植團(tuán)隊(duì)，分別于2016年和2017年在2例GTKO豬-狒狒的肝移植術(shù)后，持續(xù)給予受體輸注外源性人凝血酶原復(fù)合物(human prothrombin concentrate complex，hPCC)，并檢測外周血液循環(huán)中維生素K依賴凝血因子和非維生素K依賴凝血因子的活動度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植肝可合成并分泌凝血因子，且受體出血異常得到明顯改善。最終，2例受體存活時間分別延長至25 d[16]和29 d[5]，這也是目前以GTKO豬為供體的異種原位肝移植受體的最長存活時間記錄。

2020年，杭州啟函生物科技有限公司和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院在國際上首次成功培育出基因改造程度最大的PERV敲除豬，實(shí)現(xiàn)了“13種基因編輯”，即PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)。該基因編輯小型豬除了完全敲除PERV，還敲除了誘發(fā)異種超急性排斥反應(yīng)的3個主要抗原α-Gal、β4GalNT2和CMAH，并導(dǎo)入了9個人源化基因以抗急性排斥。隨后，筆者團(tuán)隊(duì)將其作為供體，實(shí)施了豬-恒河猴異種心臟、肝臟和腎移植的臨床前研究，探索了此種類型供體豬在異種器官移植中的臨床應(yīng)用前景。心臟采用腹部異位心臟移植術(shù)；肝臟采用脾窩異位輔助性肝移植術(shù)；腎臟采用臨床常規(guī)的左髂窩腎移植術(shù)，并切除受體自身的雙側(cè)腎臟。免疫抑制方案為：術(shù)前抗胸腺細(xì)胞球蛋白+眼鏡蛇毒因子+CD20抗體+CD40抗體，術(shù)后CD40抗體+嗎替麥考酚酯+他克莫司+甲基強(qiáng)的松龍。手術(shù)過程順利，各移植物血流恢復(fù)后均顯示顏色紅潤、質(zhì)地柔軟、血流灌注狀態(tài)良好。其中，移植心臟即刻復(fù)跳，搏動規(guī)律有力；移植肝臟有金黃色的膽汁從膽管流出；移植腎可見尿液從輸尿管中流出。心臟、肝和腎移植受體的存活時間分別為7、26和1 d，分別死于下腔靜脈血栓形成、凝血紊亂所致低血壓和嚴(yán)重心律失常。尸檢后的病理檢查結(jié)果顯示，在移植終點(diǎn)，移植心臟和腎組織結(jié)構(gòu)接近正常，而移植肝臟表現(xiàn)為片狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，并伴有明顯炎癥損傷、間質(zhì)出血和血栓性微血管病。上述實(shí)驗(yàn)在世界范圍內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了PERV敲除聯(lián)合3種主要異種抗原基因敲除(GalT、β4GalNT2、CMAH)，以及抑制補(bǔ)體活化(hCD46、hCD55、hCD59)、調(diào)節(jié)凝血紊亂(hTHBD、hTFPI、hCD39)、抗炎抗吞噬(hB2M、hHLA-E、hCD47)的9種人源化基因轉(zhuǎn)入，是目前基因改造程度最大、人源化程度最高的供體豬類型。理論上，該類供體既可解決異種器官移植后PERV交叉感染及超急性排斥反應(yīng)的問題，也可以降低異種器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)和凝血功能紊亂等問題。研究結(jié)果顯示，移植物再灌注后顏色紅潤、質(zhì)地柔軟、血流灌注狀態(tài)良好，提示GalT、β4GalNT2、CMAH敲除可抑制異種移植超急性排斥反應(yīng)，與其他學(xué)者前期的研究結(jié)果一致。但是，隨著受體生存期延長，移植肝臟出現(xiàn)明顯的體液性排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為片狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，并伴有炎癥損傷、間質(zhì)出血和血栓性微血管病等，提示供體豬9種人源化基因的轉(zhuǎn)入并不能完全避免異種移植物損傷。該研究中，肝移植受體突破了豬-猴輔助性肝移植國際同類術(shù)式最長存活時間記錄，在一定程度上證實(shí)了PERV-KO/3-KO/9-TG豬在改善移植排斥反應(yīng)、受體凝血異常等方面仍有自身優(yōu)勢，但其能否作為臨床異種器官移植的潛在供體仍需進(jìn)一步評估[17]。此外，PERV敲除理論上可阻斷病毒跨物種傳播。該研究也提示PERV不會傳播到受體血液或組織中，但PERV監(jiān)測仍然是一個值得關(guān)注的問題，尤其是在長期存活的受體當(dāng)中。

3 異種肝移植臨床試驗(yàn)受體選擇標(biāo)準(zhǔn)探討

考慮到長期療效和當(dāng)前公眾對異種移植的接受程度，筆者建議以豬為供體的異種肝移植的初步臨床試驗(yàn)，應(yīng)側(cè)重于暴發(fā)性肝衰竭、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和原發(fā)性同種異體肝移植失敗等患者。這些情況下，患者往往由于缺少有效的替代療法，且無法及時獲得同種供肝而死亡。此時，可考慮應(yīng)用異種肝移植作為一種“橋接治療”的方式，支持患者渡過最危險的時刻，直至自身肝功能恢復(fù)或等到獲得同種供肝進(jìn)行移植。如果此類臨床試驗(yàn)獲得成功，再加上對供體豬進(jìn)行更為完善、全面的基因修飾改造，有理由相信，以豬為供體的異種肝移植有望成為有效的臨床治療方式。

美國學(xué)者Horslen等[18]最早提出以下標(biāo)準(zhǔn)，可考慮應(yīng)用異種肝移植作為橋接治療：(1)急性肝衰竭患者在ICU持續(xù)治療后病情進(jìn)一步惡化；(2)適合行同種異體肝移植的患者；(3)肝性腦病，并進(jìn)展為Ⅳ級昏迷；(4)已行氣管內(nèi)插管且短期內(nèi)無法拔除；(5)顱內(nèi)壓監(jiān)測中出現(xiàn)極端腦灌注壓；(6)缺少合適的同種異基因供肝。

英國國民健康服務(wù)(National Health Service，NHS)肝臟咨詢小組為急性肝衰竭患者制定了一套超緊急的選擇標(biāo)準(zhǔn)(其中至少1項(xiàng)必須滿足)(表1)[19]。該標(biāo)準(zhǔn)可以被考慮用于選擇患者行原位豬肝移植，再“過渡”到同種異體移植的臨床試驗(yàn)。

表1 英國NHS急性肝衰竭超緊急選擇標(biāo)準(zhǔn)

總的來講，在異種肝移植開始臨床試驗(yàn)之前，選擇最佳患者對于試驗(yàn)?zāi)芊袢〉贸晒χ陵P(guān)重要。目前最妥善的方案是將受試者范圍定為具有嚴(yán)重或危及生命疾病的受者，這類患者需要立即接受器官移植治療，但因缺少捐贈器官，無法及時得到恰當(dāng)?shù)闹委煻劳鯷20]。這些患者不符合接受同種異體移植的標(biāo)準(zhǔn)，例如高齡(>65歲)、骨骼肌減少癥、慢加急性肝衰竭和同時患有其他重大疾病等，并被判定為“因病重而無法移植”。利用異種肝移植的“橋接治療”，可能延長此類晚期患者的生存期，延長“移植窗口期”，促進(jìn)同種異基因肝移植的成功，并降低死亡率。

4 小結(jié)

盡管凝血功能障礙仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，但基因編輯豬的肝臟已經(jīng)能夠在非人靈長類動物體內(nèi)有功能存活近30 d，這為異種肝移植進(jìn)入臨床試驗(yàn)奠定了重要基礎(chǔ)。同時，PERV-KO/3-KO/9-TG豬在克服超急性排斥反應(yīng)、緩解體液性排斥反應(yīng)及凝血紊亂方面具有一定優(yōu)勢，是當(dāng)前臨床異種器官移植最有價值的潛在供體。然而，異種器官移植臨床前研究實(shí)施難度大，受體依從性差，給藥窗口窄，用藥、護(hù)理等術(shù)后管理也十分困難。這些問題，需要多學(xué)科通力合作去解決。隨著異種移植研究事業(yè)的推進(jìn)，相信異種移植終將走向臨床實(shí)用，徹底解決供體短缺的難題，造福人類！

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李霄負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索，撰寫論文；竇科峰負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。