肝硬化門靜脈高壓癥患者脾切除后早期血栓形成與Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路的關(guān)系

王 歡， 申曉旭， 陳良琪， 龔天蘭

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科， 貴州 550002

肝硬化門靜脈高壓癥指的是由于肝組織過度纖維化導(dǎo)致門靜脈系統(tǒng)壓力增加從而引發(fā)的一系列癥候群，是臨床肝硬化患者的常見病和多發(fā)病[1]。目前對于肝硬化門靜脈高壓的手術(shù)治療方式，主要為脾切除聯(lián)合賁門周圍血管離斷術(shù)[2]。而患者術(shù)后形成門靜脈血栓是肝硬化門靜脈高壓患者脾切除術(shù)后發(fā)生的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。報(bào)道[3-4]顯示，患者術(shù)后門靜脈血系統(tǒng)血栓的發(fā)生率可高達(dá)22.2%～37.5%，但是由于大部分患者發(fā)生門靜脈血栓后早期臨床癥狀不明顯，導(dǎo)致患者治療不及時(shí)，治療效果不佳，從而可能危及患者生命安全。目前，關(guān)于患者術(shù)后發(fā)生門靜脈血栓的機(jī)制尚未闡明，研究患者術(shù)后門靜脈血栓發(fā)生機(jī)制，對于術(shù)后門靜脈血栓的預(yù)防和治療具有著重要價(jià)值。本研究探討分析肝硬化門靜脈高壓患者脾切除后血栓形成情況與Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月—2020年4月在本院因肝硬化門靜脈高壓行脾切除斷流術(shù)患者198例作為研究對象，其中，男117例、女81例，年齡23～75歲，平均年齡(48.93±11.54)歲；BMI(22.97±3.16)kg/m2。乙型肝炎肝硬化患者135例、丙型肝炎肝硬化患者32例、酒精性肝硬化患者22例，原發(fā)性膽汁性肝硬化患者7例，特發(fā)性門靜脈高壓患者2例。

術(shù)后隨訪3個(gè)月，根據(jù)患者術(shù)后是否發(fā)生門靜脈血栓將其分為血栓組(n=41)和非血栓組(n=157)。采用彩超檢測門靜脈血栓情況，采用SIEMENS ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀，3.0～5.0 MHz寬頻凸陣探頭，清晨空腹左側(cè)臥位，于右上腹肋間斜切面監(jiān)測門靜脈主干及分支血栓情況。所有患者均在術(shù)后1周、出院前行腹部彩超檢測，任何一次檢查出血栓均納入血栓組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前均經(jīng)臨床診斷為肝硬化門靜脈高壓癥，且經(jīng)胃鏡檢查證實(shí)患者存在食管胃底靜脈曲張，曲張靜脈直徑5 mm以上或可見紅色征(曲張靜脈表面出現(xiàn)鞭痕樣、櫻桃紅樣或血泡樣改變)時(shí)行試管靜脈套扎聯(lián)合胃底靜脈硬化劑注射；(2)消化道無出血史；(3)符合脾切除斷流術(shù)手術(shù)指征，包括脾功能亢進(jìn)以及脾大引起的白細(xì)胞、血小板減低,食道靜脈紅斑，且術(shù)前評估可耐受手術(shù)治療；(4)肝功能Child-Pugh分級A～B級；(5)患者及其家屬自愿簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝癌或其他惡性腫瘤患者；(2)術(shù)前合并凝血功能異常(包括凝血四項(xiàng)指標(biāo)、血小板、血栓彈力圖異常)或術(shù)前已經(jīng)有血栓形成；(3)由于其他原因需要進(jìn)行抗凝治療患者；(4)術(shù)前合并機(jī)體重要器官功能障礙；(5)術(shù)后發(fā)生胰瘺、腹腔出血或合并嚴(yán)重感染等相關(guān)并發(fā)癥患者；(6)術(shù)后3個(gè)月內(nèi)因非門靜脈血栓并發(fā)癥死亡患者。

1.3 方法

1.3.1 術(shù)后處理方法 患者均行脾切除術(shù)，且均由本院同一組手術(shù)醫(yī)護(hù)人員執(zhí)行，于左肋緣下作切口切除腫大脾臟，離斷食管下段至少6 cm及以上半胃漿膜層全部血供，胃冠狀靜脈、左膈下靜脈以及胃短靜脈等，包括與上述血供靜脈伴行的同名動(dòng)脈以及迷走神經(jīng)干。用細(xì)線間斷縫合胃大下彎前后壁漿膜，使其漿膜化。

術(shù)后給予患者門靜脈血栓預(yù)防抗凝措施，包括術(shù)后12 h開始應(yīng)用低分子肝素，200 IU/kg體質(zhì)量/12 h皮下注射，連續(xù)注射5 d；進(jìn)食后停用低分子肝素，改用口服華法林2.5 mg/d抗凝治療6個(gè)月，抗凝目標(biāo)為：凝血酶原活動(dòng)度50%～70%，國際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.25～1.50。當(dāng)術(shù)后血小板超過正常值上限后單用或者聯(lián)合使用抗血小板藥物治療，包括雙嘧達(dá)莫、阿司匹林以及噻氯匹定等，直至血小板恢復(fù)正常值后停止使用。

1.3.2 臨床資料收集 收集并記錄患者臨床資料，包括姓名、性別、年齡、肝功能Child-Pugh分級、是否為病毒性肝炎、靜脈曲張嚴(yán)重程度分級、術(shù)前內(nèi)鏡下治療、是否合并門靜脈高壓性胃病、手術(shù)前后門靜脈直徑、手術(shù)前后門靜脈流速差、手術(shù)前后門靜脈壓力差、脾容量(經(jīng)腹部B超檢查測量)、腹水量、手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量、BMI、術(shù)后7 d血清C反應(yīng)蛋白(CRP)、視覺模擬評分(VAS)。

1.3.3 JAK-STAT通路表達(dá)檢測 分別于術(shù)前1 d、術(shù)后7 d，抽取兩組患者清晨空腹靜脈血，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用Trizol試劑提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。引物由Invitrogen公司合成，引物序列為，JAK2上游引物：5′-TTCTACATGGGGGGATAG-3′，下游引物：5′-TAAGTATGGAAACCCTCTAA-3′；STAT3上游引物：5′-GGTTAGAACCCTACACGAAG-3′，下游引物：5′-CTACAGA GCCCACTATCCG-3′；β-actin上游引物：5′-CGTGGACATCCGCAAA GAC-3′；下游引物：5′-AAGAAAGGGTGTAACGCACT-3′。采用實(shí)施熒光定量PCR法進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共完成35個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析 血栓組41例患者經(jīng)治療后，血栓均消失。血栓組患者術(shù)前門靜脈直徑、術(shù)后門靜脈直徑、門靜脈流速差、脾容積均顯著高于非血栓組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 兩組手術(shù)前后JAK-STAT通路表達(dá) 術(shù)后兩組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK2 mRNA及STAT3 mRNA相對表達(dá)量較術(shù)前顯著升高(P值均<0.05)，同時(shí)血栓組患者JAK2 mRNA及STAT3 mRNA相對表達(dá)量升高程度明顯高于非血栓組(P值均<0.05)(表2)。

2.3 多因素Logistic回歸分析 對上述比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各因素進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，門靜脈流速差、術(shù)后JAK2 mNRA、術(shù)后STAT3 mRNA及術(shù)前門靜脈直徑為影響患者術(shù)后門靜脈血栓發(fā)生的重要因素(P值均<0.05)(表3)。

2.4 ROC曲線分析術(shù)后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓的預(yù)測價(jià)值 采用ROC曲線分析患者術(shù)后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達(dá)量對門靜脈血栓預(yù)測價(jià)值，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積分別為0.850、0.787(表4，圖1)。

3 討論

肝硬化門靜脈高壓主要臨床表現(xiàn)為脾腫大以及脾功能亢進(jìn)，同時(shí)伴有腹水、便血、嘔血等。目前對于肝硬化門靜脈高壓患者行脾切除的目的主要包括：改善脾功能亢進(jìn)而引起的血小板減少，減少門靜脈血流、降低門靜脈高壓，改善食管胃底靜脈曲張，減少消化道再次出血傾向[5-6]。目前研究[7]顯示，對于肝硬化門靜脈高壓患者采取脾切除術(shù)治療，其臨床效果顯著，既能有效降低患者門靜脈壓力，又能有效糾正機(jī)體脾功能亢進(jìn)狀態(tài)。

表2 兩組患者手術(shù)前后JAK-STAT通路表達(dá)

表1 單因素分析

表4 術(shù)后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓預(yù)測價(jià)值ROC曲線分析

圖1 ROC曲線分析術(shù)后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓的預(yù)測價(jià)值

血小板是血液的有形成分之一，有一定的形態(tài)和體積，是由骨髓巨核細(xì)胞質(zhì)裂解而來的無核細(xì)胞，血小板可通過釋放凝血因子、黏附以及聚集等功能在止血過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。對于肝硬化患者，由于脾功能亢進(jìn)、脾臟腫大以及患者血液中存在抗性血小板抗體或抗巨核細(xì)胞抗體，而導(dǎo)致機(jī)體血小板數(shù)量減少，同時(shí)加之存在骨髓抑制從而引起血小板功能的減退[10-11]。而脾切除后，患者血液流變學(xué)可出現(xiàn)血液黏滯度增加，機(jī)體呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，同時(shí)血小板可出現(xiàn)反跳性增高，因此患者術(shù)后容易出現(xiàn)門靜脈血栓等相關(guān)并發(fā)癥，對患者治療預(yù)后造成嚴(yán)重影響[12-13]。

血栓形成作為圍術(shù)期的常見并發(fā)癥之一，研究[14-15]認(rèn)為，血栓形成是一個(gè)涉及多基因、多系統(tǒng)的過程，深入分析血栓形成相關(guān)基因及其調(diào)控途徑，對于及時(shí)診斷和有效治療血栓的形成具有重要意義。JAK/STAT信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，該信號(hào)可將細(xì)胞膜感受到的信號(hào)直接傳遞至核內(nèi)，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[16-17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[18]結(jié)果顯示，JAK/STAT信號(hào)通路參與大鼠術(shù)后深靜脈血栓的形成過程，認(rèn)為JAK/STAT信號(hào)通路末端效應(yīng)基因的異常表達(dá)，可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和周期等，同時(shí)JAK/STAT信號(hào)通路可能通過氧化應(yīng)激、炎癥通路等作用而促進(jìn)術(shù)后深靜脈血栓的形成。關(guān)于肝硬化門靜脈高壓患者術(shù)后門靜脈血栓形成是否有JAK/STAT信號(hào)通路的參與，尚無相關(guān)研究報(bào)道。

本研究比較了可能影響患者術(shù)后血栓形成的各因素，結(jié)果顯示，除了術(shù)前門靜脈直徑、術(shù)后門靜脈直徑、門靜脈流速差、脾容積兩組比較具有差異外，研究可見兩組患者手術(shù)前后JAK/STAT信號(hào)通路主要基因JAK2 mRNA及STAT3 mRNA表達(dá)也出現(xiàn)了明顯變化。初步驗(yàn)證了JAK/STAT信號(hào)通路可能參與患者術(shù)后門靜脈血栓的形成，與筆者推測結(jié)果一致。此外，通過多因素Logistic回歸分析顯示，術(shù)后JAK2 mRNA及STAT3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)入回歸模式，可能是影響患者術(shù)后門靜脈血栓發(fā)生的重要因素；此外，采用ROC曲線分析患者術(shù)后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達(dá)量對門靜脈血栓預(yù)測價(jià)值，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積分別為0.850、0.787(P<0.05)。提示患者術(shù)后JAK/STAT信號(hào)通路的激活可能是門靜脈血栓形成的重要機(jī)制之一，術(shù)后JAK/STAT信號(hào)通路狀態(tài)可有效預(yù)測門靜脈血栓的形成，有望成為患者術(shù)后門靜脈血栓預(yù)防和治療的潛在生物學(xué)途徑，但是其具體的作用途徑和下游影響基因，還需要進(jìn)一步研究深入探討分析。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2017年12月23日經(jīng)由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：倫(審)2017-12-89。所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王歡負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；申曉旭參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；陳良琪、龔天蘭負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。