靈芝全麥菌糧菌種篩選及抗氧化能力評價

李楊，王鋒，朱金錦，郭鑫，張巧真，康文藝，秦嶺，顧豐穎

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)村農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；3.河南大學(xué) 國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開封 475004）

近年來，人們健康意識逐漸提升，全谷物食品得到廣泛關(guān)注。我國《糧食加工業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2011—2020年）》中明確提出“推進(jìn)全谷物健康食品的開發(fā)”和“鼓勵增加全谷物營養(yǎng)健康食品的攝入，促進(jìn)糧食科學(xué)健康消費(fèi)”，這也為全谷物食品發(fā)展提供了政策保障。全麥類谷物食品的開發(fā)研究日益受到重視。全麥?zhǔn)称繁Ａ袅他熎?、胚芽和胚乳，營養(yǎng)豐富，與精磨小麥粉食品相比，食用品質(zhì)差，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，種類少。因此，改良全麥產(chǎn)品食用品質(zhì)，強(qiáng)化其營養(yǎng)性能有效提高全麥利用和打開市場。食用菌發(fā)酵通?？捎行Ы到饫w維素等大分子物質(zhì)，有助于改善食品的食用品質(zhì)[1]。靈芝（Ganoderma lucidum）屬藥食兩用真菌，其菌絲體在生長過程中，能夠通過自身的代謝活動轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生多糖、萜類、肽類、腺苷、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和維生素、黃酮以及多酚化合物等[2]天然活性物質(zhì)。目前，靈芝菌株發(fā)酵提升食品功能活性的研究眾多，如利用靈芝發(fā)酵小麥[3]、玉米[4-5]、大米[6]、豆渣[7]、辣椒粉[8]、西洋參[9]等。靈芝菌發(fā)酵可不同程度提高發(fā)酵基質(zhì)的營養(yǎng)價值，如HAN等[4]利用靈芝發(fā)酵玉米粉，還原糖含量從4.2%提高到20.6%，蛋白質(zhì)含量也從11.0%顯著上升到16.5%。張命龍等[10]利用靈芝發(fā)酵牛蒡根，發(fā)現(xiàn)核苷和蛋白質(zhì)含量升高，并產(chǎn)生新的三萜酸和腺苷。除此之外，靈芝菌發(fā)酵可改善發(fā)酵基質(zhì)中大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和加工特性[4]，提高基質(zhì)中可溶性膳食纖維的比例[11]和抗氧化[12]、抗腫瘤活性及活性物質(zhì)含量[13]，賦予發(fā)酵基質(zhì)調(diào)節(jié)腸道菌群、促睡眠和提高免疫力等功能[14]。但不同靈芝菌株對這些基質(zhì)的利用及產(chǎn)生活性成分的能力有差異，如羅瑩等[15]用靈芝發(fā)酵玉米碴、黃豆、黑豆、花生、蕎麥米、燕麥米、大米，研究發(fā)現(xiàn)黃豆培養(yǎng)基和黑豆培養(yǎng)基具有更好的營養(yǎng)價值。陳飛等[16]發(fā)現(xiàn)不同菌株間固態(tài)發(fā)酵菌絲得率、多糖和三萜含量的差異較大，紫芝菌絲得率最高，達(dá)到21.66%，云芝單位菌絲體多糖含量最高，為8.16%；赤芝和樹舌靈芝單位菌絲體三萜含量最高，分別為1.13%和1.08%。根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期目的，選擇合適的發(fā)酵基質(zhì)和菌株尤為重要[17]。目前國內(nèi)外學(xué)者對靈芝發(fā)酵全麥的研究較少，適宜工業(yè)化應(yīng)用的品種尚未明確，選擇適合的靈芝菌株研究尚且有限。

本研究以全麥為發(fā)酵基質(zhì)，綜合比較5種靈芝全麥菌糧發(fā)酵過程中菌絲體生長速度、生物活性物質(zhì)的累積能力及抗氧化活性水平，以高效高活性為目標(biāo)，篩選適宜工業(yè)化靈芝全麥菌糧生產(chǎn)的菌株，為全麥菌糧的深層次開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

永良15號小麥，北京金土地農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所；美國大靈芝（MZ）、日本赤靈芝（RZ）、韓國靈芝（HZ）購自北京吉蕈園科技有限公司，赤芝（LZ）、川圓芝（CZ）來源于實(shí)驗(yàn)室保存，它們都屬于多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純），美國Fisher Scientific公司；DPPH試劑盒、ABTS+試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；其他主要試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。供試1260 II HPLC系統(tǒng)、紫外檢測器為美國安捷倫公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 靈芝全麥菌糧制備參考雷彤彤[18]的方法，略加修改。將接種靈芝菌的全麥于28℃條件下，靜置培養(yǎng)53d；烘干（50℃，18h）磨粉，過80目篩，即為菌糧。以未接菌的滅菌全麥為空白對照。靈芝全麥菌糧制備工藝流程如下。

1.2.2 靈芝菌絲體生長速度測定培養(yǎng)基配制：20g微晶纖維素/木聚糖、0.5g硫酸銨、1g酵母浸粉、0.5g硫酸鎂、1g磷酸二氫鉀、20g瓊脂、1L蒸餾水，pH自然，121℃滅菌30min，備用。

平板接種：用接種針將MZ、RZ、CZ、LZ、HZ在PDA培養(yǎng)基平板上活化，28℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，再轉(zhuǎn)接到新的平板上，28℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板，用無菌打孔器制造出直徑為8mm的菌塊，分別在微晶纖維素培養(yǎng)基和木聚糖培養(yǎng)基中央接種1塊菌塊，28℃下黑暗靜置培養(yǎng)，每2d取1次樣。

1.2.3 靈芝全麥菌糧中三萜及甾醇含量的測定及單體三萜定性分析靈芝三萜及甾醇含量參照《中華人民共和國藥典》[19]中靈芝三萜及甾醇測定方法。

參考張蕊多[20]的提取方法制備單體三萜提取液。色譜條件：液相色譜分離是在Agilent SB AQ Column(100mm×3.0mm，1.8μm)系統(tǒng)上進(jìn)行的；有機(jī)相為乙腈，無機(jī)相為水，進(jìn)行梯度洗脫(0～25min，乙腈-水體積比98∶2；25～31min，乙腈-水體積比2∶98）；進(jìn)樣量為2.0μL；柱溫為40℃；流速為0.2mL·min-1。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜檢測是在Agilent 6560 Q-TOF mass spectrometer系統(tǒng)上進(jìn)行的；離子源為ESI；質(zhì)量掃描范圍100～1800m·z-1；掃描模式Negative mode；噴霧氣壓力40psi；干燥氣流速13.0L·min-1；干燥氣溫度350℃；錐孔電壓70V；毛細(xì)管電壓3500V；碎裂電壓500V；動態(tài)碰撞能量30±10（eV）。用Agilent Mass Hunter Workstation software Qualitative Analysis軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 靈芝全麥菌糧中總多糖含量的測定參考朱翠玲等[21]方法提取多糖，稱取1.00g靈芝全麥菌糧，加入蒸餾水，水浴加熱90℃下提取2h，室溫離心（4000r·min-1，3min）收集上清液，重復(fù)提取1次，合并濾液。濃縮、乙醇沉淀12h，室溫6000r·min-1離心5min收集多糖沉淀，沉淀物熱水復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，冷卻，加水至刻度，搖勻，稀釋，即得待測樣。參照《中華人民共和國藥典》[19]中多糖測定方法測定多糖含量。

1.2.5 靈芝全麥菌糧中結(jié)合酚和游離酚含量的測定游離酚與結(jié)合酚溶液提取：參考WANG等[22]方法略加修改，取0.5g靈芝全麥菌糧，加入乙醇，室溫（25℃，250r·min-1）振蕩10min，將該混合物以6000r·min-1離心10min，收集上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至2mL，蒸餾水定容至20mL，獲得游離酚待測樣。離心后的殘留物繼續(xù)加入氫氧化鈉水解，隨后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，加入乙酸乙酯，6000r·min-1離心10min，收集上清液，重復(fù)2次。收集的提取物進(jìn)一步濃縮至干，加入0.5mL80%乙醇溶液，再加入5mL蒸餾水，獲得結(jié)合酚待測樣。

游離酚與結(jié)合酚含量測定：福林酚法測定酚類物質(zhì)的含量，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，760nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0837X+0.0558，R2=0.9964，線性范圍0～4.4μg·mL-1進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 靈芝全麥菌糧中腺苷含量的測定參考來李娟等[23]的方法提取和測定腺苷含量，色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：甲醇-0.01mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（13:87）；流速：1mL·min-1；檢測波長；260nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL；時間：15min；洗脫方式：等度洗脫；以腺苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度和峰面積為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=17.134X+0.4357，R2=1線性范圍0～54μg·mL-1進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 靈芝全麥菌糧中麥角甾醇含量的測定麥角甾醇溶液提取：參考劉京晶等[24]方法，略加修改，稱取0.3g靈芝全麥菌糧，加入2mL無水乙醇，靜置過夜。13000r·min-1離心10min，將上清倒入10mL容量瓶中。沉淀中再加入2mL無水乙醇，超聲30min（300W），13000r·min-1離心10min。合并兩次上清液，用無水乙醇定容?；靹蚝筮^0.22μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。

麥角甾醇含量測定：參考雷彤彤[18]的方法，略加修改，色譜柱：ZORBAX SB-Aq柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：100%甲醇；流速：1mL·min-1；檢測波長：282nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；時間：15min；洗脫方式：等度洗脫。以麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度和峰面積為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=14.196X+0.6346，R2=1線性范圍0～28.2μg·mL-1進(jìn)行計(jì)算。

1.2.8 靈芝全麥菌糧抗氧化活性測定樣品溶液提?。悍Q取0.2g樣品，加入1mL提取液（DPPH、ABTS+試劑盒中的提取液）后置于40℃水浴鍋中浸提30min；10000r·min-1室溫離心10min，取上清，DPPH樣品提取液稀釋1倍后，置于冰上待測。

DPPH、ABTS+自由基清除能力測定：按照DPPH、ABTS+試劑盒說明配制試劑并測定。

1.2.9 灰色理論關(guān)聯(lián)分析參考梅淑芳等[25]灰色關(guān)聯(lián)分析法對5種靈芝菌的發(fā)酵效果進(jìn)行加權(quán)關(guān)聯(lián)分析，綜合評價并篩選適合全麥發(fā)酵的靈芝菌。根據(jù)產(chǎn)業(yè)需求及應(yīng)用價值，設(shè)置各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)：生長速度0.2、三萜及甾醇0.2、多糖0.1、結(jié)合酚0.1、游離酚0.1、腺苷0.1、麥角甾醇0.1、清除DPPH能力0.05、清除ABTS+能力0.05。1.2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析每個樣品的各項(xiàng)指標(biāo)均測定3次以上。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 26數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，采用Origin93_64進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌絲體的生長情況比較分析

2.1.1 靈芝菌在纖維素培養(yǎng)基中的生長情況全麥的麩質(zhì)層中通常含有較高含量的纖維素、半纖維素等，具有纖維素降解能力的靈芝有益于提高發(fā)酵效率。由圖1可知，0～3d內(nèi)靈芝菌在纖維素培養(yǎng)基上開始萌發(fā)，后期生長加快，第7天各靈芝菌絲圈在微晶纖維素培養(yǎng)基上直徑從大到小為：MZ＞RZ＞LZ＞CZ＞HZ，在木聚糖培養(yǎng)基上直徑從大到小為：MZ＞RZ＞LZ＞HZ＞CZ。MZ在微晶纖維素（纖維素）和木聚糖（半纖維素）培養(yǎng)基上生長最快，MZ在第7天剛好長滿平板（9cm），其他靈芝菌未長滿平板。結(jié)果表明MZ在固體培養(yǎng)基中生長較快。

圖1 靈芝在微晶纖維素培養(yǎng)基（a）和木聚糖培養(yǎng)基（b）上菌落直徑變化情況Figure 1 Changes in colony diameter of Ganoderma lucidum on microcrystalline cellulose medium(a)and xylan medium(b)

2.1.2 靈芝菌在全麥培養(yǎng)基中的生長情況由圖2可知，在相同培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)MZ生長最快，其次是RZ和LZ靈芝，而CZ和HZ生長較慢；MZ、RZ、LZ、CZ、HZ長滿瓶所需時間分別為6，7，7，11，13d，這與菌株分解纖維素、半纖維素分解能力大小一致。

圖2 靈芝菌絲體長滿全麥培養(yǎng)基天數(shù)Figure 2 Days of Ganoderma lucidum mycelium covered with whole wheat media

2.2 靈芝全麥菌糧中活性物質(zhì)的含量比較分析

2.2.1 靈芝三萜及甾醇三萜類化合物是靈芝重要的特征活性成分之一。由圖3可知，靈芝全麥菌糧中靈芝三萜及甾醇含量順序?yàn)椋篗Z＞CZ＞RZ＞HZ＞LZ，MZ全麥菌糧中三萜及甾醇含量最高，達(dá)（10.55±0.33）mg·g-1，是發(fā)酵前的2.01倍。其次是CZ，含量為（7.75±1.02）mg·g-1，是發(fā)酵前的1.48倍，而RZ、LZ和HZ產(chǎn)三萜及甾醇能力最弱，含量與未發(fā)酵全麥相比沒有顯著差異。

利用LC-O-TOF-MS分析靈芝三萜及甾醇含量較高的2種靈芝全麥菌糧（MZ與CZ）中三萜化合物組成。由表1可知，2種菌糧均可檢出麥角甾醇，但靈芝酸的種類存在一定區(qū)別。MZ和CZ全麥菌糧分別有14和13種靈芝酸被檢出，靈芝酸DM、TN、H僅在MZ菌糧中檢出，靈芝酸T-Q和T也是CZ獨(dú)有的。張蕊多[20]利用靈芝發(fā)酵刺五加，分析出發(fā)酵物中含有12種活性物質(zhì)，其中有5種物質(zhì)在MZ和CZ全麥菌糧中同樣被檢出，分別是靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸C6、靈芝酸G和靈芝酸Mj。

2.2.2 腺苷靈芝腺苷是一種以核苷和嘌呤為基本構(gòu)造的具有強(qiáng)烈藥理活性的物質(zhì)，也是靈芝的主要有效成分之一[14]。由圖3可知，經(jīng)過53d的發(fā)酵，5種靈芝全麥菌糧中腺苷含量都顯著提高。各全麥菌糧中腺苷含量由高到低為MZ＞CZ＞LZ＞RZ＞HZ，其中MZ全麥菌糧中的腺苷含量最高，含量為（0.23±0.01）mg·g-1是發(fā)酵前2.88倍。RZ、LZ、CZ全麥菌糧中腺苷含量無顯著差異。

表1 MZ、CZ全麥菌糧中可能含有的單體三萜Table 1 Possible monomeric triterpenoids contained in MZ and CZ whole wheat fungus grain

2.2.3 麥角甾醇麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜特有成分，同時具有一定的生物活性。麥角甾醇的濃度在相同的物種之間是不同的，這取決于真菌的生理狀態(tài)[26]。由圖3可知，發(fā)酵前全麥中未檢出麥角甾醇，不同菌種發(fā)酵的靈芝全麥菌糧中麥角甾醇含量由高到低為：MZ＞RZ＞LZ≈HZ＞CZ。MZ全麥菌糧中麥角甾醇含量顯著高于其他4種靈芝全麥菌糧，含量為（0.39±0.01）mg·g-1。麥角甾醇可以間接反應(yīng)菌絲體的生物量。麥角甾醇含量越高，說明靈芝菌在此基質(zhì)上生長狀態(tài)良好，這與2.1中靈芝菌生長速度的研究結(jié)果一致。

圖3 靈芝全麥菌糧中三萜及甾醇(STZC)、麥角甾醇(MJZC)和腺苷(XG)含量Figure 3 Triterpenoids and sterol(STZC),ergosterol(MJZC),and adenosine(XG)in Ganoderma lucidum whole wheat fungus grain

圖4 靈芝全麥菌糧中多糖含量Figure 4 Polysaccharides in Ganoderma lucidum whole wheat fungus content in grain

2.2.4 總多糖靈芝多糖為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖通過不同比例和不同糖苷鍵類型連接構(gòu)成[27]。全麥中也含有大量的多糖，如淀粉、纖維素等。靈芝全麥菌糧中測定總多糖包含有小麥多糖和靈芝多糖。由圖4可知，5種靈芝全麥菌糧中的多糖含量都較未發(fā)酵全麥高，LZ、HZ產(chǎn)多糖能力較強(qiáng)，MZ、RZ、CZ全麥菌糧中多糖含量差異不顯著。各靈芝全麥菌糧中多糖含量由高到低為LZ＞HZ＞CZ＞RZ≈MZ。LZ全麥菌糧中總多糖含量為（55.22±3.74）mg·g-1，是發(fā)酵前的2.31倍。

2.2.5 結(jié)合酚和游離酚由圖5可知，經(jīng)過53d發(fā)酵，5種靈芝全麥菌糧游離酚含量顯著高于對照組，其中RZ全麥菌糧最高，含量為（2.49±0.08）mg·g-1，是發(fā)酵前的7.78倍。HZ、LZ、MZ全麥菌糧中游離酚含量差異不顯著，CZ全麥菌糧中的游離酚含量顯著低于其他4種靈芝全麥菌糧（p＜0.05)。MZ全麥菌糧中結(jié)合酚的含量為（0.48±0.01）mg·g-1顯著高于發(fā)酵前，HZ和RZ、LZ、CZ差異顯著。發(fā)酵前，全麥中結(jié)合酚的含量高于游離酚，發(fā)酵后全麥中游離酚的含量顯著高于結(jié)合酚。發(fā)酵后游離酚類物質(zhì)顯著提高，其可能有兩種原因，一是發(fā)酵過程中靈芝菌代謝產(chǎn)生了酚類小分子化合物，靈芝菌中存在聚酮代謝途徑[28]并且聚縮酮的生物合成能夠產(chǎn)生多酚[29]，二是靈芝菌有豐富的酶系（淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶等）可以分解谷物細(xì)胞壁并釋放酚類化合物[30]。

2.3 靈芝全麥菌糧的抗氧化活性分析

由圖6可知，5種靈芝全麥菌糧清除DPPH及ABTS+的能力都顯著高于對照組。菌糧中的活性組分可以迅速與DPPH和ABTS+自由基反應(yīng)，對于DPPH和ABTS+自由基，靈芝全麥菌糧分別有（33.10±0.34）%～（40.70±0.72）%和（65.14±2.23）%～（81.75±3.73）%的清除效果，而對照樣品(未發(fā)酵的全麥)的效果僅分別為（12.27±0.73）%和（17.30±0.13）%。顯然，靈芝固態(tài)發(fā)酵全麥產(chǎn)生具有清除作用的化合物。靈芝全麥菌糧清除DPPH、ABTS+的能力從大到小為：MZ＞RZ＞LZ＞CZ＞HZ、RZ＞LZ＞MZ＞HZ＞CZ。MZ全麥菌糧DPPH清除能力最強(qiáng)，清除率為（40.70±0.72）%，是發(fā)酵前的3.31倍。RZ全麥菌糧ABTS+清除能力最強(qiáng)，清除率為（81.75±3.73）%，是發(fā)酵前的4.72倍。結(jié)果表明，MZ全麥菌糧清除DPPH能力最強(qiáng)，而RZ全麥菌糧清除ABTS+能力較強(qiáng)。

圖5 靈芝全麥菌糧中游離酚(YLF)和結(jié)合酚(JHF)含量Figure 5 Content of free phenol(YLF)and bound phenol(JHF)in Ganoderma lucidum whole wheat fungus grain

圖6 靈芝全麥菌糧DPPH清除率(DP)和ABTS+清除率(AB)Figure 6 DPPH scavenging rate(DP)and ABTS+scavenging rate(AB)of Ganoderma lucidum whole wheat fungus grain

2.4 靈芝全麥菌糧中活性物質(zhì)及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

對靈芝全麥菌糧中主要活性物質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），發(fā)現(xiàn)麥角甾醇與腺苷（r=0.881，p＜0.05）顯著正相關(guān)；游離酚與DPPH清除率（r=0.911，p＜0.05）顯著正相關(guān)，與ABTS+清除率（r=0.961，p＜0.01）存在極顯著正相關(guān)；ABTS+清除率與DPPH清除率（r=0.9474，p＜0.01）極顯著正相關(guān)。

2.5 靈芝全麥菌糧灰色綜合評判值及等級排序

靈芝菌株發(fā)酵能有效提高全麥中功能活性物質(zhì)的含量和抗氧化能力，不同的菌株在不同活性成分累積能力上表現(xiàn)出明顯差異。對于靈芝全麥菌糧來說，評價菌株的優(yōu)劣，需要綜合評估。利用灰色理論評估，灰色綜合評判值越大，菌株越適合發(fā)酵全麥。由表3可知，各菌糧的灰色綜合評判值從大到小為：MZ＞LZ＞RZ＞CZ＞HZ，綜合評估，MZ為最佳發(fā)酵菌株。

表2 靈芝全麥菌糧中活性物質(zhì)及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between active substances and antioxidant activity in Ganoderma lucidum whole wheat fungus grain

表3 靈芝全麥菌糧灰色綜合評判值及等級排序Table 3 Gray comprehensive evaluation value and grade ranking of Ganoderma lucidum whole wheat fungus grain

3 討論與結(jié)論

參考日本赤靈芝小麥菌糧標(biāo)志化合物靈芝三萜和靈芝酸在菌糧累積規(guī)律的前期研究[18]，本研究將MZ、RZ、CZ、HZ、LZ全麥菌糧的發(fā)酵終點(diǎn)定為53d。全麥經(jīng)過53d的發(fā)酵后，活性物質(zhì)含量都顯著高于未發(fā)酵全麥。靈芝三萜及甾醇、麥角甾醇、靈芝腺苷、靈芝多糖是靈芝中重要的活性成分，靈芝三萜及甾醇具有廣泛的生物和藥理活性，胡瓊方[31]以550g玉米為基料，接入靈芝菌種得到靈芝發(fā)酵粉中三萜含量為0.161%。譚顯東等[32]用靈芝發(fā)酵三七渣，發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜含量為0.37%，略低于靈芝全麥菌糧，本研究得到的三萜及甾醇含量在0.52%～1.06%之間。麥角甾醇是食用菌中的功能活性成分之一，屬于三萜類物質(zhì)。王曉琴等[33]測定的赤芝、紫芝、靈芝孢子粉中麥角甾醇單位占比分別為0.109%、0.046%、0.124%，較靈芝全麥菌糧中麥角甾醇含量高；雷彤彤[18]測定的RZ全麥菌糧含量（0.023%）與靈芝全麥菌糧相似。腺苷是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體[13]。本研究檢測的腺苷含量與相關(guān)文獻(xiàn)相比，全麥菌糧中腺苷含量在0.013%～0.023%之間，靈芝、菌絲體、靈芝菌絲發(fā)酵基質(zhì)中腺苷含量均在0.01%～0.2%之間[13,23,34]，與靈芝發(fā)酵茶湯[13]相比差異不顯著，但較菌絲體和靈芝含量較低。靈芝多糖具有多方面的藥理活性，胡瓊方[31]利用靈芝發(fā)酵玉米，發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量為7.1087%，略高于本研究中LZ全麥菌糧（5.522%）?；钚晕镔|(zhì)含量之間的差異可能與其提取方式、原料、菌種和發(fā)酵時間等有關(guān)。為了得到高活性的靈芝全麥菌糧，發(fā)酵工藝還需近一步優(yōu)化。

靈芝全麥菌糧各活性物質(zhì)、抗氧化活性各指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明（表2），腺苷與三萜及甾醇、麥角甾醇（真菌細(xì)胞膜上特有成分）含量呈正相關(guān)。靈芝腺苷屬于核苷類物質(zhì)，核苷又是組成RNA、DNA必不可少的物質(zhì)[13]。隨著菌絲體的生長，麥角甾醇含量增加，腺苷含量相應(yīng)也會升高。靈芝全麥菌糧中多糖含量和三萜及甾醇含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。MZ菌糧中多糖含量最低，而三萜及甾醇含量最高，這可能與菌絲體生長速度（MZ生長速度快）有關(guān)。三萜及甾醇一般在發(fā)酵后期不斷積累，而多糖的積累一般發(fā)生在發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時間的延長前期代謝生成的多糖可能發(fā)生降解，導(dǎo)致含量逐漸降低。這檢測結(jié)果與陳飛等[15]利用不同品種靈芝發(fā)酵工業(yè)副產(chǎn)物得到的結(jié)果相似，其所研究的云芝發(fā)酵基質(zhì)多糖含量最高，而三萜及甾醇含量最低。除酚類物質(zhì)外，三萜、多糖、麥角甾醇都有一定的抗氧化能力[35-37]。RZ全麥菌糧ABTS+清除率最高，這可能與游離酚含量相關(guān)。ABTS+清除率與游離酚呈現(xiàn)正相關(guān)，BHANJA等[38]也報(bào)道了總酚含量和ABTS+清除活性是高度相關(guān)的。MZ全麥菌糧清除DPPH效果最好，可能是靈芝全麥菌糧中其他成分對DPPH清除效果更好，如三萜、甾醇、結(jié)合酚等。

全麥經(jīng)靈芝菌發(fā)酵后，靈芝全麥菌糧中三萜及甾醇、腺苷、麥角甾醇、多糖、多酚（游離酚與結(jié)合酚）的含量顯著增加，抗氧化活性明顯提升。發(fā)酵后靈芝全麥菌糧清除DPPH及ABTS+能力提升4倍。以發(fā)酵效率、活性物質(zhì)累積能力為指標(biāo)，綜合評估(灰色理論)從5種靈芝菌種中篩選出一種適宜全麥發(fā)酵的菌株（MZ）。通過MZ發(fā)酵可使全麥多酚（游離酚與結(jié)合酚）、三萜甾醇、腺苷、麥角甾醇含量分別達(dá)到（2.23±0.06）mg·g-1，（10.55±0.33）mg·g-1、（0.23±0.01）mg·g-1、（0.39±0.01）mg·g-1，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。