TTC在菌落總數(shù)檢測中的應(yīng)用探討

菌落總數(shù)反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價(jià)，因而菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣[1]。然而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，被檢樣品如綠豆糕等在滅菌生理鹽水中并不能完全溶解，導(dǎo)致在培養(yǎng)基中出現(xiàn)與菌落形態(tài)相似的樣品顆粒，使菌落計(jì)數(shù)增加了難度。這對于實(shí)驗(yàn)新人或者經(jīng)驗(yàn)不夠的實(shí)驗(yàn)人員來說，很容易錯把樣品顆粒當(dāng)作菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。但通過查閱資料發(fā)現(xiàn)，可以在培養(yǎng)基中添加2,3,5-三苯基氯化四氮唑（又稱TTC）溶液，以區(qū)分平板上生長的菌落與樣品顆粒[2]。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中添加的TTC濃度為5.0 mg/100 mL，但有相關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為TTC濃度在2.0 mg/100 mL時(shí)為最佳[3]?，F(xiàn)將該方法引用至食品檢測中，然后選取TTC濃度在0～5 mg/100 mL，探討TTC在菌落總數(shù)檢測中的適宜濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

綠豆糕：超市自購；大腸埃希氏菌：ATCC25922；鼠傷寒沙門氏菌：ATCC14028；金黃色葡萄球菌：ATCC6538；蠟樣芽孢桿菌：ATCC11778；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：ATCC19115。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

氯化鈉（廣東光華）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（上海麥克林）；PCA培養(yǎng)基（陸橋）。

1.3 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋：YXQ-100A（上海博訊）；電子天平：BP-622B-X（上海奔普）；均質(zhì)器：LC-08（寧波立誠）；培養(yǎng)箱：GHP-9160N型（上海一恒）；生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X（濟(jì)南鑫貝西）；立式冷凍柜：BD-330WEPTU1（青島海爾）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌液制備

從4 ℃冰箱中取出大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的工作菌株，先挑取斜面菌苔于生理鹽水管中做成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，然后按?0倍系列稀釋法，使菌懸液濃度在104～105CFU·mL-1。

1.4.2 TTC溶液制備

取1 g TTC粉末溶于100 mL蒸餾水中，配制成1%TTC溶液，于121 ℃高壓滅菌15 min后冷藏備用。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟

選擇滅菌后的綠豆糕作為樣品基質(zhì)，取25 g樣品加入到225 mL滅菌生理鹽水中，共制備6份。取一份樣品不添加任何菌液，作為樣品空白對照，觀察有無菌落生長。剩余5份樣品分別加入大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌懸液各1 mL。按照10倍系列稀釋法，對以上5份添加了菌懸液的樣品進(jìn)行稀釋。每個樣品各做10組，并編號X0為對照組，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和 X9為實(shí)驗(yàn)組。

分別將0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL和0.50 mL配制好的1%TTC溶液加入到冷卻至46 ℃的100 mL PCA瓊脂培養(yǎng)基中，然后傾注到 X0、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9等樣品平皿中并混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板倒置，36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落結(jié)果并計(jì)數(shù)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC對大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)的影響

由表1可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，添加TTC溶液的實(shí)驗(yàn)組隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異（以lg差絕對值表示）[5-6]。

表1 TTC對大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)的影響表

2.2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)的影響

由表2可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，添加TTC溶液的實(shí)驗(yàn)組隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異。

表2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)的影響表

2.3 TTC對金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的影響

由表3可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，但是TTC濃度≥3.5 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)較對照組有明顯差異，且TTC濃度為5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落不生長。

表3 TTC對金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的影響表

2.4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)的影響

由表4可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異，但TTC濃度≥4.0 mg/100 mL時(shí)，菌落不生長。

表4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)的影響表

2.5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計(jì)數(shù)的影響

由表5可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落生長不受影響。

表5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計(jì)數(shù)的影響表

3 結(jié)論與討論

TTC是一種氧化還原指示劑，溶于水中形成無色溶液[7-8]。如果添加TTC的培養(yǎng)基中有細(xì)菌存在，細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將無色的TTC還原為紅色的三苯甲臢，使菌落變成紅色[3]。

①在大腸埃希實(shí)驗(yàn)中，TTC濃度為0.5 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，顯淺粉色；TTC濃度在1.0～5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。②在鼠傷寒沙門氏菌實(shí)驗(yàn)中，TTC濃度為0.5～1.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色顯淺粉色；TTC濃度為1.5～5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。③在金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)中，TTC濃度為0.5～1.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色顯淺粉色；TTC濃度在1.5～3.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色；TTC濃度在3.5～4.0 mg/100 mL時(shí)，菌落顏色呈深紫色，但菌落數(shù)與對照組有明顯差異；TTC濃度為5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落不生長。④在蠟樣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)中，TTC濃度為0.5～3.5 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺粉色到紫色；TTC濃度為4.0～5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落不生長。⑤在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實(shí)驗(yàn)中，TTC濃度為0.5～1.5 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色為淺粉色；在2.0～5.0 mg/100 mL時(shí)，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。

綜上所述，當(dāng)TTC濃度在2.0～3.5 mg/100 mL時(shí)，可以既不影響菌落生長，又能使菌落顯色。

實(shí)驗(yàn)中所選取的大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌均為革蘭氏陰性菌株，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTC的添加對它們的生長影響不大；金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌、蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性桿菌，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTC的添加對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長影響不大，但對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的生長影響很大。所以，TTC濃度對球菌和芽孢菌的生長影響關(guān)系還待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。