鄧皓月，朱 娛，吳 躍，李清暉，田昆侖，劉良明，李 濤

400042重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

隨著全球經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，海上交通愈發(fā)頻繁，與此同時(shí)國際海難統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指出全世界每年發(fā)生近萬次海難[1]。由于海水具有低溫、高滲、富含特殊致病微生物等特點(diǎn)，創(chuàng)傷合并海水浸泡的死亡率較陸地傷高出幾倍甚至十幾倍[2]。海上事故的預(yù)防與救援日益受到重視，研究失血休克合并低溫海水浸泡的病理生理特點(diǎn)對進(jìn)一步研究制定海戰(zhàn)傷早期救治措施具有重要意義。

創(chuàng)傷失血、休克所致死亡占創(chuàng)傷早期死亡的30%～40%，而多器官功能障礙(multi organ dysfunction syndrome，MODS)是創(chuàng)傷失血休克最嚴(yán)重的并發(fā)癥，居ICU患者死因首位[3-4]。既往海水浸泡聯(lián)合失血休克的研究主要集中在基礎(chǔ)生命體征(如呼吸、心率、體溫及肌顫變化)[5]、血漿蛋白質(zhì)組(如肺表面相關(guān)蛋白A、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K)[1]等指標(biāo)，對器官功能、組織代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響研究較少。近40年來，我國渤海、黃海、東海等海域表層海水溫度呈緩慢上升趨勢[6]，全年平均海水表層溫度為18.9～21.5 ℃[7]。據(jù)此，本研究以21 ℃海水浸泡合并40%失血休克大鼠為模型，觀察21℃海水對失血休克大鼠存活、器官功能、組織代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響，探索海戰(zhàn)傷落水傷員的病理生理變化特點(diǎn)，為制定急救方案提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和耗材

戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司，肝素鈉購自中國海普瑞藥業(yè)有限公司，氯化鈉注射液購自中國山東金洋藥業(yè)有限公司，青霉素和硫酸鏈霉素購自中國河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，Na+/K+-ATP酶試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所，注射器購自中國山東威高集團(tuán)，真空采血管購自中國康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12～14周齡健康SD大鼠128只，雄性，體質(zhì)量為200～220 g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在照明周期為12 h/d的標(biāo)準(zhǔn)明暗條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物房室溫設(shè)定為26 ℃，給予標(biāo)準(zhǔn)化飼料和飲用純凈水，實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人工海水配置 采用國家海洋局第三研究所的配方，主要指標(biāo)包括：滲透壓(1250.00±11.52)mmol/L，鈉離子濃度(630.00±5.33)mmol/L，鉀離子濃度(10.88±0.68)mmol/L，氯離子濃度(658.80±5.25)mmol/L，海鹽濃度2.54%，pH=8.20，海水溫度21 ℃。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方案及模型制備 根據(jù)計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組法將大鼠分為4組(n=32)：正常對照組(對照組)、40%失血休克組(休克組)、正常大鼠21℃海水浸泡組(海水組)及40%失血休克合并21 ℃海水浸泡組(休克+海水組)。實(shí)驗(yàn)分3批完成，第1批實(shí)驗(yàn)(n=16)用于觀察各組大鼠72 h存活情況，第2批實(shí)驗(yàn)(n=8)用于檢測器官功能指標(biāo)，第3批實(shí)驗(yàn)(n=8)用于檢測生化及組織代謝指標(biāo)。利用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(45 mg/kg)SD大鼠，待大鼠肌張力消失后進(jìn)行固定，行右頸動(dòng)脈插管，后經(jīng)三通管連接注射器與水銀血壓計(jì)，以監(jiān)測平均動(dòng)脈壓與放血，同側(cè)頸總動(dòng)脈放置溫度探頭測定核心體溫。待大鼠穩(wěn)定10 min后，將其垂直浸泡于21 ℃海水中，腋窩以上露出水面，使其保持正常呼吸。對照組僅做插管處理；休克組僅進(jìn)行40%控制性失血處理；海水組僅進(jìn)行插管和海水浸泡處理；休克+海水組自大鼠入水起開始放血，1 h內(nèi)放至全身血量的40%，持續(xù)在海水中浸泡2 h，取出后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 存活情況 建模成功后，結(jié)扎頸動(dòng)脈并縫合肌肉層、皮膚層，于休克前及放血后肌肉注射(10萬U/kg)青霉素、硫酸鏈霉素，放回籠中自由進(jìn)食飲水，并記錄大鼠72 h內(nèi)的存活時(shí)間。

1.4.2 器官功能指標(biāo) 對照組和休克組在建模起2 h后，海水組和休克+海水組在浸泡末分別抽取5 mL動(dòng)脈血檢測心臟功能[肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)]、肝臟功能[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)]、腎臟功能[血尿素(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)]。

1.4.3 生化指標(biāo) 對照組和休克組在建模起2 h后，海水組和休克+海水組在浸泡末分別抽取3 mL動(dòng)脈血送陸軍特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科檢測生化指標(biāo)[血漿滲透壓(plasma osmolality，OSM)、Na+、K+、Cl-]。

1.4.4 組織代謝指標(biāo) 各組完成生化指標(biāo)檢測血樣采集后分別取肺與腦組織稱量其濕質(zhì)量，利用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9070)60℃烘烤24 h至恒量，采用干濕質(zhì)量法測定組織的含水量；將肺與腦組織分別與9倍體積生理鹽水混合后冰水浴下機(jī)械勻漿，離心后取上清液，再以生理鹽水稀釋10倍，后根據(jù)Na+/K+-ATP酶試劑盒操作步驟進(jìn)行酶促反應(yīng)和定磷，最終通過公式計(jì)算組織的Na+/K+-ATP酶活力單位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 21 ℃海水浸泡對失血休克大鼠生存情況的影響

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)休克組大鼠的72 h存活率為50.00%，中位存活時(shí)間為53.48 h；21 ℃海水浸泡可致正常大鼠死亡，72 h存活率為68.75%；而21 ℃海水浸泡可顯著加速40%失血休克大鼠的死亡，72 h存活率降至18.75%，中位存活時(shí)間縮至10.50 h，與休克組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖1A、B)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與休克組比較；c：P<0.05，與海水組比較

2.2 21 ℃海水浸泡對失血休克大鼠主要器官功能的影響

2.2.1 心臟功能 與正常組比較，休克組大鼠cTnT顯著升高至(1.85±0.91)μg/L(P<0.05，圖2A)；21 ℃海水浸泡后cTnT顯著升高至(1.39±0.34)μg/L(P<0.05，圖2A)；而21 ℃海水浸泡進(jìn)一步加劇40%失血休克大鼠cTnT的升高，達(dá)(7.25±0.66)μg/L，與休克組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。

2.2.2 肝臟功能 休克組大鼠ALT、AST較對照組分別升高104.19%、188.17%，升至(75.00±7.85)、(298.95±24.48)U/L(P<0.05，圖2B、C)；海水組ALT、AST較對照組分別升高82.38%、148.12%，升至(66.99±5.62)、(257.40±36.85)U/L(P<0.05，圖2B、C)；21 ℃海水浸泡進(jìn)一步升高40%失血休克大鼠ALT、AST升至(118.60±13.29)、(455.95±46.76)U/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B、C)。

2.2.3 腎臟功能 休克組大鼠BUN、SCr較對照組分別升高104.19%、188.17%，升至(11.89±1.74)、(43.48±4.81)μmol/L(P<0.05，圖2D、E)；海水組BUN、SCr較對照組分別升高82.38%、148.12%，升至(9.87±1.20)、(39.03±3.35)μmol/L(P<0.05，圖2D、E)；21 ℃海水浸泡進(jìn)一步升高40%失血休克大鼠BUN、SCr，升至(19.74±2.12)、(56.73±4.08)μmol/L，與休克組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2D、E)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與休克組比較；c：P<0.05，與海水組比較A：心臟功能；B、C：肝臟功能；D、E：腎臟功能

2.3 21 ℃海水浸泡對失血休克大鼠組織代謝的影響

2.3.1 肺腦含水量 休克組和海水組大鼠肺腦含水量與對照組比呈上升趨勢，而21 ℃海水浸泡顯著增加失血休克大鼠肺腦含水量，分別增至(79.38±0.85)%、(79.19±0.77)%，與休克組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1)。

2.3.2 肺腦Na+/K+-ATP酶活性 休克組和海水組大鼠肺腦Na+/K+-ATP酶活性均較對照組顯著降低(P<0.05，表1)，而21 ℃海水浸泡使失血休克大鼠肺腦Na+/K+-ATP酶活性進(jìn)一步降低，降至(3.81±0.30)、(7.17±0.51)U/mg，與休克組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1)。

表1 大鼠血漿組織代謝指標(biāo)變化情況

2.4 21 ℃海水浸泡對失血休克大鼠內(nèi)環(huán)境的影響

休克組和海水組大鼠血漿OSM、Na+、K+和Cl-均較對照組高，21 ℃海水浸泡進(jìn)一步升高失血休克大鼠上述指標(biāo)，分別升至(301.13±1.19)、(142.20±0.63)、(5.10±0.17)、(114.84±0.98)mmol/L，與休克組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2，P<0.05)。

表2 大鼠血漿生化指標(biāo)變化情況

3 討論

創(chuàng)傷失血休克后，全身循環(huán)血量急劇減少，組織缺血缺氧，進(jìn)而引發(fā)MODS，這一系列的病理生理變化大大增加了創(chuàng)傷失血休克的死亡率。既往研究指出，海水浸泡可引發(fā)機(jī)體核心體溫降低、酸中毒及凝血功能障礙，對機(jī)體造成極大的危害[8]。而海上作業(yè)與遠(yuǎn)海作戰(zhàn)中，落水傷員遭受創(chuàng)傷與海水浸泡的雙重打擊，加之海水具有高滲、富含特殊致病微生物等特點(diǎn)，創(chuàng)傷合并海水浸泡的死亡率遠(yuǎn)高于陸地傷[2，9-10]。本研究以40%失血休克大鼠合并21 ℃海水浸泡為模型，發(fā)現(xiàn)21 ℃海水浸泡可明顯加劇失血休克大鼠的內(nèi)環(huán)境紊亂、組織代謝障礙、MODS并顯著增加死亡率。

本研究采用失血休克合并海水浸泡模型，一方面，由于40%失血休克導(dǎo)致機(jī)體循環(huán)血量銳減，組織器官灌注不足缺血缺氧導(dǎo)致Na+/K+-ATP酶活性降低，ATP生成不足，細(xì)胞膜上Na+、K+的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，使細(xì)胞外K+不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致血漿K+升高，OSM增加[11]。另一方面，海水屬于高滲、強(qiáng)堿性液體，滲透壓是人體血漿滲透壓的4.3倍[2，8]，海水浸泡可引起高滲性脫水，導(dǎo)致血液濃縮，失血休克合并海水浸泡后進(jìn)一步引起機(jī)體OSM、Na+、K+和Cl-升高；此外海水較體溫低，長時(shí)間浸泡可導(dǎo)致血管通透性增加，使血漿進(jìn)入第三間隙引發(fā)組織水腫，同時(shí)引發(fā)低溫性利尿，血液濃縮，使血漿黏滯度增加[12]，影響血液攜氧能力，進(jìn)一步加重失血休克引發(fā)的內(nèi)環(huán)境失衡、組織缺血缺氧及代謝障礙，包括Na+/K+-ATP酶活性降低，最終對機(jī)體多臟器功能造成嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生致命危害[13-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)失血休克大鼠存在多器官功能受損，而失血休克大鼠合并21 ℃海水浸泡后心、肝、腎功能明顯損害，較單純休克大鼠器官功能損傷程度明顯加重，這可能與低溫及海水兩方面的因素有關(guān)。機(jī)體40%失血休克后，循環(huán)總量減少，加上低溫海水浸泡促進(jìn)血管收縮及心輸出量減少，機(jī)體血容量不足以滿足全身臟器需求。因休克時(shí)血液優(yōu)先供應(yīng)腦、心臟等重要臟器，腎臟因灌注不足而功能受損[15-16]，與本研究中BUN、SCr指標(biāo)升高相符。同時(shí)，低溫刺激引發(fā)肝代謝率降低、肝功能合成酶的活性改變，最終致使肝功能受損[16]，即AST和ALT明顯升高。當(dāng)機(jī)體后期無法代償，出現(xiàn)心肌收縮力、心輸出量、心率及血壓降低，進(jìn)入缺血缺氧的惡性循環(huán)，出現(xiàn)心臟功能受損，最終導(dǎo)致多器官功能障礙[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21 ℃海水浸泡可通過加劇40%失血休克大鼠內(nèi)環(huán)境紊亂及組織代謝障礙，導(dǎo)致多器官功能損傷加重，促使死亡率升高。因此，針對海水浸泡戰(zhàn)創(chuàng)傷傷員，盡早給予有效的復(fù)溫，糾正電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡及調(diào)節(jié)滲透壓的補(bǔ)液方式，同時(shí)增加保護(hù)器官功能等針對性措施可能有效降低死亡率。目前，對于失血休克合并海水浸泡患者早期救治方案的研究甚少，我們將在本實(shí)驗(yàn)病理生理學(xué)變化特點(diǎn)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究針對性的防治措施研究。