陳建高，饒承龍，劉文正，吳 潘，王旭冉，南棟琪，楊文波，毛旭虎

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))藥學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)系臨床微生物與免疫學(xué)教研室

類鼻疽伯克霍爾德菌(

Burkholderia

pseudomallei

,

B.

pseudomallei

)簡稱類鼻疽菌，是一種能引起人畜共患類鼻疽病的革蘭陰性短桿菌，兼具B類生物威脅因子和Ⅰ類生物恐怖戰(zhàn)劑的特性，嚴(yán)重威脅人類的健康和公共衛(wèi)生安全。類鼻疽主要流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)，包括我國海南、廣東、福建、香港、臺灣等省市。隨著全球氣候的變化、交通的便利、經(jīng)貿(mào)文化交流的頻繁，其人群感染發(fā)生率逐年增高，可預(yù)見我國出現(xiàn)類鼻疽疫情的危險性將越來越高。加強類鼻疽菌感染致病機制的研究，對其有效防控具有重要的理論指導(dǎo)意義。

病原菌與宿主的相互作用是感染和致病的前提。為了深入研究類鼻疽菌在感染免疫過程中細菌與宿主的相互作用，前期課題組建立了如DAPI直接染色、類鼻疽菌特異性抗體免疫熒光染色等研究手段，但其存在分辨率不高、操作繁瑣、不能活體觀察等缺點。因此，建立一種活菌熒光示蹤的方法，有利于在細胞、組織或動物模型中持續(xù)動態(tài)地觀察該菌的感染與致病過程。目前國內(nèi)尚無熒光標(biāo)記類鼻疽菌構(gòu)建的報道，本文以類鼻疽菌常用的廣泛宿主pUCP28T載體為骨架質(zhì)粒，以常用的綠色、紅色和藍色熒光蛋白(green/red/blue fluorescent protein，GFP/RFP/BFP)為標(biāo)記物，通過DNA重組技術(shù)將上述熒光基因分別克隆到載體pUCP28T上，以電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入重組質(zhì)粒，構(gòu)建多種熒光標(biāo)記的類鼻疽菌，用于類鼻疽菌在細胞、動物體內(nèi)的分布、定殖和存活情況以及其致病機制的研究方面。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細胞 類鼻疽菌BPC006菌株由本室分離鑒定并保存，大腸桿菌DH5α由本室保存。pUCP28T-16 S質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存，GFP-RFP-LC3質(zhì)粒由日本大阪大學(xué)Tamotsu Yoshimori教授惠贈，pUCP24T-BFP質(zhì)粒由陸軍軍醫(yī)大學(xué)顧江教授惠贈。穩(wěn)定表達GFP-LC3的小鼠巨噬細胞RAW264.7購于漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.2 試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶

Xba

Ⅰ、

Hind

Ⅲ、

Spe

Ⅰ和高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、DL-2000 marker、DL-10000 marker等均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司，IL-8細胞因子檢測試劑盒購于達科為生物技術(shù)有限公司。4%多聚甲醛和抗熒光猝滅封片劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，共聚焦皿購自NEST公司。

AppliedBiosystems PCR儀，美國ABI公司；微生物電穿孔儀MicroPulser，0.2 cm電擊杯，酶標(biāo)儀，凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；動態(tài)活細胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)DeltaVision，美國GE公司；多功能智能成像系統(tǒng)iBrightCL1500，美國Thermo公司；水平電泳槽，HE-90型電泳儀，上海天能科技有限公司；熒光顯微鏡CELENA?S，韓國Logos biosystemes公司。

1.1.3 細菌和細胞培養(yǎng) 類鼻疽菌BPC006和大腸桿菌DH5α均在LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 rmp振蕩培養(yǎng)。RAW264.7和A549細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。甲氧芐啶使用濃度250 μg/mL。所有涉及類鼻疽菌的實驗操作在生物安全P2+實驗室進行，并嚴(yán)格按照實驗室生物安全規(guī)范操作。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GFP-RFP-LC3質(zhì)粒的

gfp

和

rfp

基因序列設(shè)計引物GFP-F/R和RFP-F/R，并在GFP-F/R引物5’端分別插入

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ酶位點，在RFP-F/R引物5’端分別插入

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ酶位點；同理根據(jù)pUCP24T-BFP質(zhì)粒的

bfp

基因設(shè)計引物BFP-F/R，并在上下游引物5’端插入

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ酶位點。引物均由華大基因科技有限公司合成。本實驗所用引物序列詳見表1。

表1 熒光質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定引物

基因片段引物名稱引物序列(5'→ 3')限制性核酸內(nèi)切酶片段大小bfpBFP-FGCTCTAGAATGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGXbaⅠ713BFP-RCCAAGCTTACTAGTTTAGTGCCCCAGTTTGCTAGGGAGHind Ⅲ、SpeⅠgfpGFP-FTTTCTAGAATGATTAAAGGAGAAGAACTTTTCACXbaⅠ733GFP-RCCAAGCTTTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCCHind ⅢrfpRFP-FGCTCTAGAATGGCGAGTAGCGAAGACGXba Ⅰ689RFP-RGGACTAGTTAAGCACCGGTGGAGTGACGACSpe Ⅰ

1.2.2 綠色/藍色/紅色熒光蛋白(

gfp

/

bfp

/

rfp

)基因的擴增 以質(zhì)粒GFP-RFP-LC3為模板，分別以GFP-F/R和RFP-R/F為上下游引物進行PCR擴增獲得

gfp

/

bfp

基因片段。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Prime STAR? GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，Prime STAR?HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL，DMSO 2 μL，ddHO 16.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸1.5 min。同理，以質(zhì)粒pUCP24T-BFP為模板，以BFP-F/R為上下游引物PCR擴增獲得

bfp

基因片段。將PCR擴增的

gfp

/

bfp

/

rfp

基因用1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，具體實驗步驟參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)說明。1.2.3 含熒光基因(

gfp

/

rfp

/

bfp

)重組表達質(zhì)粒pUCP28T-

gfp

/

rfp

/

bfp

的構(gòu)建 將膠回收的

gfp

/

bfp

基因和pUCP28T質(zhì)粒經(jīng)

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，然后涂布于含250 μg/mL甲氧芐啶的LB平板進行篩選，挑取陽性單克隆菌落，于250 μg/mL甲氧芐啶的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，取少量菌液送華大基因科技有限公司測序驗證，其余菌液離心后提質(zhì)粒，用

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切鑒定。由于

rfp

基因上存在兩個

Hind

Ⅲ酶切位點，故需將構(gòu)建成功的pUCP28T-BFP質(zhì)粒和

rfp

基因經(jīng)

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切后連接，同上，獲得pUCP28T-RFP質(zhì)粒，后續(xù)用

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切驗證。1.2.4 類鼻疽菌BPC006電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備 從LB固體平板挑BPC006單菌落于5 mL SOB培養(yǎng)基震蕩過夜，再按1∶10比例將過夜培養(yǎng)菌液接種到新鮮 SOB培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)到

D

(600)為0.6～0.8。將菌液置于冰上放置20 min，再于4 ℃，2 000 g，離心10 min，取50 mL預(yù)冷的無菌ddHO洗滌一遍后離心，菌沉淀再用25 mL預(yù)冷的10%無菌甘油洗滌2遍，離心沉淀收集菌體，加10%甘油500 μL重懸，每100 μL每管分裝于-80 ℃暫存。

1.2.5 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BPC006感受態(tài)細胞 將感受態(tài)細胞BPC006與重組質(zhì)粒以10∶1體積于冰上混勻，加入到冰上預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，冰上放置10 min。3 kV、200 Ω、25 μF電擊后(時間常數(shù)為4.5～5 ms)，立即加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，37 ℃振蕩孵育2 h，取200 μL菌液涂布含250 μg/mL甲氧芐啶的LB平板，37 ℃孵箱培養(yǎng)36 h，挑單菌落重懸于適量的4%多聚甲醛中固定，取10 μL滴于載玻片，在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的菌落即為陽性克隆。

1.2.6 熒光菌株表達穩(wěn)定性檢測 將熒光類鼻疽菌BPC006接種于無抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每隔16～18 h按0.1%的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的無抗LB培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代20次，取樣適量稀釋后，涂布于無抗LB平板(3個重復(fù))，置于孵箱37 ℃培養(yǎng)36 h，于多功能智能成像系統(tǒng)iBrightCL1500下拍照觀察熒光菌落，并計算熒光菌落數(shù)/總菌落數(shù)，即為熒光菌株的穩(wěn)定表達率。

1.2.7 炎性因子IL-8的檢測 將類鼻疽菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)10感染人肺上皮細胞A549，共孵2 h后加入250 μg/mL的卡那霉素，再孵育1 h后，置換新鮮的無抗完全DMEM培養(yǎng)基，分別在感染12、24 h收集感染細胞培養(yǎng)上清，并按說明書步驟檢測IL-8含量。

1.2.8 活細胞成像系統(tǒng)觀察類鼻疽菌與自噬標(biāo)記分子LC3的實時動態(tài)變化 將穩(wěn)定表達GFP-LC3的小鼠巨噬細胞RAW264.7以1.5×10接種于激光共聚焦皿中，于細胞培養(yǎng)箱中(5% CO，37 ℃)過夜培養(yǎng)。選取紅色熒光類鼻疽菌以MOI為10感染RAW264.7細胞，感染1.5 h后，用PBS清洗共聚焦皿3遍，然后加卡那霉素到250 μg/mL，孵育0.5 h后，PBS洗3遍，換無抗的完全DMEM培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡上進行免疫熒光檢測，并在高分辨率活細胞成像系統(tǒng)上動態(tài)觀察類鼻疽菌與自噬標(biāo)記分子LC3共聚的動態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記類鼻疽菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 首先通過PCR擴增分別從模板上獲得熒光基因

gfp

/

rfp

/

bfp

片段，經(jīng)目的片段和載體雙酶切后連于含有16 S啟動子的表達載體pUCP28T上，構(gòu)建重組表達熒光質(zhì)粒(圖 1A～C)。具體地，

gfp

/

rfp

/

bfp

基因的PCR擴增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約750 bp處有1條特異的DNA條帶，與GFP、RFP、BFP基因理論大小一致。接著，將連接成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中進行復(fù)制擴增，菌液抽提質(zhì)粒后，質(zhì)粒pUCP28T-GFP和pUCP28T-BFP用

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切鑒定，質(zhì)粒pUCP28T-RFP用

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切鑒定，均得出了與理論大小相符的酶切條帶(圖 1D)，并將重組質(zhì)粒送至公司測序。測序結(jié)果顯示插入片段正確，表明

gfp

/

rfp

/

bfp

基因均已成功克隆到類鼻疽菌表達載體pUCP28T質(zhì)粒中。

A、B、C分別為熒光質(zhì)粒pUCP28T-GFP、pUCP28T-BFP、pUCP28T-RFP構(gòu)建示意圖；D： 熒光質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 M: DL-2000標(biāo)準(zhǔn)；1: pUCP28T；2: pUCP28T-GFP；3: pUCP28T-RFP；4: pUCP28T-BFP；5～8分別為Xba Ⅰ和Hind Ⅲ或Spe Ⅰ分別雙酶切鑒定pUCP28T、pUCP28T-GFP、pUCP28T-RFP、pUCP28T-BFP載體

2.1.2 熒光蛋白的表達 將構(gòu)建成功的熒光重組質(zhì)粒pUCP28T-GFP、pUCP28T-RFP、pUCP28T-BFP分別電轉(zhuǎn)化到類鼻疽菌BPC006中，在含甲氧芐啶的LB平板上挑取生長菌落制片，在熒光顯微鏡下，通過發(fā)光表型篩選到了陽性克隆(圖 2)。

圖2 熒光顯微鏡觀察構(gòu)建的熒光標(biāo)記類鼻疽菌的熒光效果

2.2 熒光標(biāo)記類鼻疽菌的生物學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 細菌生長特性的檢測 考慮到外源性GFP、RFP、BFP蛋白的表達對類鼻疽菌自身生長繁殖能力有無影響，我們通過體外培養(yǎng)未標(biāo)記和熒光標(biāo)記細菌，繪制生長曲線。如圖所示，熒光標(biāo)記細菌在體外培養(yǎng)條件下生長繁殖能力與未標(biāo)記細菌無明顯差異(圖 3)。

未標(biāo)記菌：無熒光標(biāo)記類鼻疽菌；GFP/RFP/BFP分別表示綠色、紅色、藍色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌；將體外液體LB培養(yǎng)中的細菌進行D(600)吸光度檢測，繪制生長曲線

2.2.2 感染細胞能力的變化 在前期研究的工作基礎(chǔ)上，炎癥因子IL-8的變化是評價類鼻疽菌感染A549細胞模型的重要檢測指標(biāo)。與對照組相比，未標(biāo)記與標(biāo)記菌株在感染12和24小時后均可以引起炎癥因子IL-8的表達明顯上調(diào)，且無明顯差異，提示熒光標(biāo)記類鼻疽菌感染宿主細胞的能力較未標(biāo)記菌株無明顯差異(圖 4)。

陰性對照：未感染組；未標(biāo)記菌：無熒光標(biāo)記類鼻疽菌；GFP/RFP/BFP分別表示綠色、紅色、藍色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌 a：P <0.01,與陰性對照比較

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性檢測 將綠色和紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌經(jīng)連續(xù)稀釋傳代20次后，在無抗LB平板上仍能培養(yǎng)出帶有熒光的菌落(圖 5)，且熒光菌落占總菌落數(shù)百分比為(92±5)%(綠色熒光菌)和(95±13)%(紅色熒光菌)，表明GFP和RFP標(biāo)記的重組熒光類鼻疽菌在傳代至20代時仍能穩(wěn)定表達熒光蛋白。

圖5 GFP和RFP標(biāo)記類鼻疽菌傳20代后的熒光菌落圖

2.3 熒光標(biāo)記類鼻疽菌與宿主細胞互作的應(yīng)用研究

通過活細胞成像系統(tǒng)實時動態(tài)觀察熒光標(biāo)記類鼻疽菌與宿主細胞自噬標(biāo)記分子LC3共定位的變化。在類鼻疽菌感染RAW264.7巨噬細胞2 h的細胞模型中，通過熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌熒光明亮，能夠與RAW264.7細胞中的GFP-LC3綠色熒光明顯區(qū)分(圖 6)，結(jié)果提示后續(xù)無需再對類鼻疽菌進行熒光抗體標(biāo)記，可用于直接觀察類鼻疽菌與宿主細胞自噬相互作用的動態(tài)變化過程情況。

圖6 熒光顯微鏡觀察類鼻疽菌感染RAW264.7細胞后細菌和細胞的變化

進一步，我們在高分辨率活細胞成像系統(tǒng)中實時動態(tài)觀察類鼻疽菌侵入宿主細胞后，細胞自噬與類鼻疽菌互作的動態(tài)變化情況。如圖7所示，同樣的，如上所述，在類鼻疽菌感染RAW264.7細胞2 h后，我們在活細胞工作站中觀察到隨著類鼻疽菌侵入RAW264.7細胞后，自噬標(biāo)志物GFP-LC3與紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌發(fā)生共聚，并逐漸形成包裹類鼻疽菌的自噬小體，且整個過程在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成。

圖7 高分辨率活細胞成像系統(tǒng)觀察類鼻疽菌與RAW264.7細胞內(nèi)GFP-LC3共定位的變化

3 討論

類鼻疽菌作為一種胞內(nèi)感染病原菌，為了實現(xiàn)在宿主細胞內(nèi)的生存、感染和致病，有效逃逸宿主細胞免疫清除是其成功定植和播散的前提。由于類鼻疽菌特殊的病原生物學(xué)特性，其防控還存在諸多困境，如天然耐藥、臨床癥狀不特異、缺乏快速準(zhǔn)確的臨床診斷技術(shù)、無疫苗使用等。究其原因，根本問題在于類鼻疽菌的感染與免疫機制不明確，如在類鼻疽菌感染宿主的過程中，介導(dǎo)細菌免疫逃逸的重要致病因子有哪些、它們?nèi)绾握{(diào)控宿主免疫清除、細菌-宿主免疫互作的具體分子機制如何等問題尚未闡釋清楚。因此，深入研究類鼻疽菌與宿主互作及免疫逃逸，揭示該菌致病和傳播分子機制，將為類鼻疽的防控奠定重要理論基礎(chǔ)。

本課題組長期圍繞類鼻疽菌逃逸宿主細胞免疫清除分子機制開展系統(tǒng)研究，前期工作中發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌可通過阻礙宿主細胞吞噬囊泡轉(zhuǎn)運成熟、誘導(dǎo)miRNAs靶向抑制自噬關(guān)鍵基因ATG10以及操縱NR1D2-ATGL調(diào)控軸干擾脂噬途徑從而妨礙宿主細胞自噬清除等多種途徑逃逸宿主細胞免疫清除作用，達到持續(xù)性感染的目的。但是，研究多采用細胞爬片固定后免疫熒光染色，或者提取細胞內(nèi)相關(guān)成分進行體外生化分析等，只能做到對某個時間點的記錄，無法進行類鼻疽菌與宿主細胞互作的實時動態(tài)觀察，這無疑對揭示類鼻疽菌感染免疫機制是一種研究手段的缺陷。構(gòu)建熒光標(biāo)記的類鼻疽菌活菌，將為實現(xiàn)直接、適時和動態(tài)觀察細菌與宿主的互作提供有力的工具。目前熒光標(biāo)記細菌技術(shù)已在結(jié)核分枝桿菌、軍團嗜肺菌、沙門氏菌、志賀氏菌等病原體中廣泛應(yīng)用，常用的標(biāo)記熒光包括綠色、紅色、藍色等。熒光蛋白作為細菌的標(biāo)記物具有多種優(yōu)勢，以綠色熒光蛋白為例，GFP于1974年從水母Aequorea victoria中被發(fā)現(xiàn)，相對分子量為31kD，已被用作多種真核和原核生物體的熒光標(biāo)志或者胞內(nèi)報告蛋白。比較于其他生物發(fā)光系統(tǒng)而言，GFP的優(yōu)勢體現(xiàn)在當(dāng)受到藍光或紫外光激發(fā)后發(fā)出明亮綠色熒光的過程中不需要其他輔助因子，而其獨特性質(zhì)的原因來自于它的激發(fā)中心由3個氨基酸殘基(SerTyrGly)組成的環(huán)化自動催化生色團；然后，對靶細胞進行非侵入性處理后進行熒光檢測，GFP的表達就能夠在活細胞中被直接觀察到；再者，GFP能夠在單個細胞中被檢測和定量，這不同于其他需要較多檢測裝備的標(biāo)記示蹤系統(tǒng)。因此，我們首先構(gòu)建了GFP標(biāo)記的類鼻疽菌，以期為課題組后續(xù)類鼻疽菌基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供重要的手段。同時，鑒于如果宿主細胞采用了相同的顏色標(biāo)記，本文也采用同樣的技術(shù)構(gòu)建了RFP/BFP標(biāo)記的類鼻疽菌，以滿足不同實驗條件下對不同顏色熒光標(biāo)記的需求。

啟動子對目的基因的表達至關(guān)重要。為了獲得熒光蛋白在類鼻疽菌中的高效表達，本文在前期工作中構(gòu)建了多種啟動子序列，包括類鼻疽菌的功能基因的啟動或者其他細菌的外源性啟動子，但均不能有效啟動下游熒光基因的表達甚至影響類鼻疽菌的存活，最后經(jīng)過一系列的篩選，使用了類鼻疽菌的16 S rDNA啟動子作為重組質(zhì)粒表達的啟動子，三種熒光蛋白才在類鼻疽菌中得到了理想表達，單個細菌在熒光顯微鏡下均呈現(xiàn)出不同顏色的明亮熒光。另外，我們改進了外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入類鼻疽菌的方式，在以往的研究中均采用的是通過大腸桿菌SM10接合的方式導(dǎo)入，轉(zhuǎn)化效率低且時間長；而本實驗中改用了制備類鼻疽菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)并通過電轉(zhuǎn)的方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入類鼻疽菌，轉(zhuǎn)化效率高且快速。我們還對熒光標(biāo)記的類鼻疽菌進行了生長特性和遺傳穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，和野生型BPC006一樣，構(gòu)建的工程菌體外培養(yǎng)的生長曲線基本一致，感染宿主細胞的特性也無差異表現(xiàn)，體外無選擇壓力下，連續(xù)傳代20代，細菌的熒光和質(zhì)粒保有率超過90%，完全滿足后續(xù)感染研究工作的需要。

自噬是宿主細胞通過自噬小體包裹胞內(nèi)病原菌并經(jīng)自噬-溶酶體途徑對病原體進行免疫清除的一種方式，其中LC3即自噬相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3)，是自噬過程中重要且常用的標(biāo)志蛋白。我們利用RFP標(biāo)記的類鼻疽菌和GFP-LC3標(biāo)記的RAW264.7細胞的感染模型中觀察了類鼻疽菌與宿主細胞相互作用過程中自噬的變化，熒光顯微鏡下可見紅色的細菌和綠色的細胞都分外明亮，能夠明顯區(qū)分，可用于后續(xù)類鼻疽菌與宿主自噬等互作機制的相關(guān)研究。

本文構(gòu)建的熒光蛋白穩(wěn)定表達的標(biāo)記菌株除了用于細菌與宿主細胞互作的研究，如動態(tài)監(jiān)測類鼻疽菌如何侵入細胞以及侵入的時間、逃逸吞噬囊泡的過程、與感染宿主的胞質(zhì)免疫、傳播路徑以及胞內(nèi)增殖與宿主細胞的轉(zhuǎn)歸等以外，也可通過將熒光蛋白基因與類鼻疽菌的啟動子進行融合，研究已知啟動子的調(diào)節(jié)或者鑒定在特殊環(huán)境下啟動子的活性，以及通過將熒光蛋白基因與類鼻疽菌重要致病因子基因進行融合，研究該蛋白的定位和分泌方式等；另外，熒光標(biāo)記的類鼻疽菌還可用于抗菌藥物的篩選、抗菌活性的評價等，直觀簡便快速易行。

綜上，本文構(gòu)建了多種熒光標(biāo)記的類鼻疽菌，該標(biāo)記系統(tǒng)具有高度敏感性、非侵入性熒光檢測、快速檢測和定量以及在單個活菌中檢測基因表達等優(yōu)勢。利用熒光標(biāo)記菌株，將進一步幫助我們發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌特殊的適應(yīng)性機制，提高對其持續(xù)性感染機理的認識，快速高通量篩選抗菌藥物，具有較大的應(yīng)用價值。