郭彥彤，劉仲明，張海燕，張 寶

510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院廣東省熱帶病研究重點實驗室BSL-3實驗室(廣東)1；510010 廣州，中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2

急性呼吸道疾病(acute respiratory disease，ARD)在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率中占很大比例，其中急性病毒性呼吸道感染是最常見的病因(約80%)。近年來SARS、甲型H1N1、MERS和SARS-CoV-2等多種呼吸道病原體威脅全球人類的健康與生命。僅在2021年，全國呼吸道傳染病報告發(fā)病率為104.18/10萬，病死率為0.13/10萬。實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)以高靈敏、高特異、能夠早期診斷為優(yōu)點廣泛用于臨床呼吸道病原體檢測及科學(xué)研究。傳統(tǒng)RT-qPCR檢測前均要對樣本進(jìn)行核酸提取，操作步驟復(fù)雜、耗時長，不適用于野外現(xiàn)場檢測。近年來，以即時檢測(point-of-care testing，POCT)為目標(biāo)，優(yōu)化縮短PCR反應(yīng)耗時的研究層出不窮。許多研究通過簡化樣品前處理與加速熱循環(huán)，達(dá)到縮短PCR反應(yīng)耗時的目的。其中免核酸提取和全自動核酸提取是主要的樣本處理階段簡化方式。極速熱循環(huán)(ultrafast thermocycling methods)的概念也被提出，旨在提升核酸擴增中的加熱冷卻模塊的控溫速率可準(zhǔn)確性從而達(dá)到快速完成核酸擴增的目的。主要包括電阻加熱法、熱對流、光束熱循環(huán)。MENDOZA-GALLEGOS等利用一個銅包裹的功率電阻和一個計算機風(fēng)扇制成的熱循環(huán)器作為便攜PCR設(shè)備的溫控裝置。銅包裹解決了電阻表面熱量分布不均的問題，電阻中央與兩端溫差小于0.75 ℃。LI等報告了一種金納米棒促進(jìn)微流控芯片中液滴的光學(xué)加熱方法，含有金納米棒的納升液滴由低功率808 nm波長激光器加熱，由于金納米棒的高效光熱轉(zhuǎn)換率，通過采用具有良好重現(xiàn)性的13.6 mW激光器，可使液滴溫度達(dá)到95 ℃，加熱和冷卻時間分別為200、800 ms。LI等開發(fā)了一種基于新型雙模磁化鐵成功集成FeO提供光熱轉(zhuǎn)換的納米簇的超快定量PCR系統(tǒng)。這些簇可以用脈沖激光激發(fā)，以進(jìn)行精確的熱循環(huán)調(diào)制。

本研究的對象為一種基于金屬燒結(jié)陶瓷加熱器和雙曲線風(fēng)冷技術(shù)極速熱循環(huán)檢測模塊的C7s實時熒光定量PCR儀，不僅保留常規(guī)熒光PCR儀的技術(shù)性能，同時又能顯著縮短檢測時間。3D打印技術(shù)研制的專用扁平管，以及免核酸提取一步法檢測試劑為極速熱循環(huán)實時熒光定量PCR系統(tǒng)的創(chuàng)新點的極速熱循環(huán)實時熒光定量PCR系統(tǒng)，研究選用IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和臨床樣本為檢測標(biāo)本，并與傳統(tǒng)RT-qPCR結(jié)果比較，針對此系統(tǒng)的最低檢出限、線性范圍、重現(xiàn)性、敏感度和特異度、交叉反應(yīng)和抗干擾能力等性能指標(biāo)評價研究。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料和試劑

本研究所使用的系統(tǒng)為極速熱循環(huán)實時熒光定量PCR系統(tǒng)，包括C7s實時熒光定量PCR儀型號GNM-C7s(北京金諾美生物技術(shù)有限公司)和免核酸提取一步法檢測試劑，含核酸擴增試劑和樣本處理液(珠海麗珠試劑股份有限公司)。極速熱循環(huán)系統(tǒng)將流感病毒檢測時長控制在30 min以內(nèi)。其余儀器：加樣槍(德國eppendorf公司)；生物安全柜；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；扁平管專用離心機(北京金諾美生物技術(shù)有限公司)。

樣本分別來自蘇州泓迅生物科技股份有限公司以IAV基質(zhì)蛋白1、基質(zhì)蛋白2(GenBank：KC739555.1)和IBV核輸出蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白1(GenBank：KP976412.1)為目的基因片段，克隆插入pUC-Amp載體，構(gòu)建的IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；用于臨床評價的臨床樣本來自南部戰(zhàn)區(qū)疾控中心生物安全科2016年至2018年收集的鼻/咽拭子樣本，參考《軍隊急性呼吸道傳染病病原監(jiān)測方案(2019修訂版)》：流行性感冒確診陽性175例(IAV陽性樣本88例，IBV陽性樣本87例)；流行性感冒陰性樣本103例，其中男性164人(59%)，女性114人(41%)，平均年齡24歲。

交叉反應(yīng)樣本購自北納生物的金黃色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureus

，

S.

aureu

)、流感嗜血桿菌(

Haemophilus

influenzae

，

H.

influenzae

)、肺炎鏈球菌(

Streptococcus

pneumoniae

，

S.

pneumoniae

)、呼吸道合胞病毒B(respiratory syncytial virus，RSVB)，濃度為6.0×10、1.50×10、1.50×10CFU/L和5.60×10TCID/L用于交叉反應(yīng)實驗。

臨床評價所用的對比試劑為FastKing一步法RT-PCR試劑盒(KR123)[天根生化科技(北京)有限公司]；IAV和IBV引物和探針(見表1)；磁珠法核酸提取試劑盒(廣州賽百純生物科技有限公司)。對比儀器為LightCycler?96 PCR儀(Roche公司)。

表1 IAV和IBV的引物和探針序列

病原名稱引物與探針序列(5’?3’)IAV上游引物GACCRATCCTGTCACCTCTGAC下游引物GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG探針FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1IBV上游引物TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG下游引物CGGTGCTCTTGACCAAATTGG探針FAM-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTCGTG-BHQ1

1.2 方法

1.2.1 最低檢出限評價 選取IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行系列稀釋，稀釋濃度為：1×10、1×10、1×10、1×10、1×10、1×10copies/μL。用極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1×10～1×10copies/μL)，每個稀釋樣本重復(fù)測定5次。濃度高于最低檢出限的樣本，應(yīng)每次都能被檢出。

1.2.2 極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 對IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1×10～1×10copies/μL)用極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測，每個濃度檢測3次，求平均循環(huán)數(shù)(cycle threshold， Ct)，以IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的平均Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過IBM SPSS Statistic 22作線性回歸分析，獲得回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)R，并按公式(10-1)×100%求得擴增效率。

1.2.3 重現(xiàn)性評價 從278例臨床樣本中選出IAV和IBV陽性樣本各1例，由極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測，重復(fù)檢測8次，獲得對應(yīng)的平均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)，計算變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)，公式為

1.2.4 臨床評價 使用極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測278份臨床樣本，同時根據(jù)《軍隊急性呼吸道傳染病病原監(jiān)測方案(2019修訂版)》以傳統(tǒng)RT-qPCR為金標(biāo)準(zhǔn)檢測臨床樣本，F(xiàn)astKing一步法RT-PCR試劑盒(KR123)為對比試劑進(jìn)行對比檢測，以評價此系統(tǒng)對臨床樣本檢測的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)RT-qPCR法檢測樣品的Ct值>38或無Ct值，判定樣品為陰性。

1.2.5 交叉反應(yīng)評價 在IAV、IBV陽性混合樣本以及陰性樣本中均加入

S.aureu

、

H.

influenzae

、

S.

pneumoniae

、RSVB后與常規(guī)樣本一樣處理，重復(fù)測定3次，查看檢出結(jié)果。

1.2.6 抗干擾評價 隨機挑選IAV、IBV陽性樣本各1例和陰性樣本1例，加入 30 g/dL的血紅蛋白、3.2 g/dL的甘油三酯和100 μg/mL頭孢曲松，重復(fù)測定3次，驗證抗干擾能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

對入選的278例臨床樣本使用極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)和傳統(tǒng)RT-qPCR方法進(jìn)行同步盲法對比實驗，對兩種檢測方法進(jìn)行

Kappa

一致性檢驗及陰陽性符合率計算。通過IBM SPSS Statistic 22計算陰性符合率、陽性符合率、總符合率及其95%

CI

，并對檢測結(jié)果進(jìn)行

Kappa

檢驗(

K

)。

Kappa

值為一致性系數(shù)，評價兩種檢測方法檢測結(jié)果是否一致，

Kappa

值越大，說明檢測結(jié)果越一致，若

K

≥0.75，說明兩種方法具有高度的一致性，若

K

<0.4，說明一致性差，若0.4≤

K

<0.75，說明具有良好的一致性。

2 結(jié)果

2.1 最低檢出限評價

極速熱循環(huán)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)檢測IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果見表2，擴增曲線見圖1，此系統(tǒng)檢測IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限為1×10copies/μL。

表2 IAV、IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)Ct值

拷貝量(copies/μL)IAVIBV1×10033.2137.611×10132.1835.971×10228.4232.871×10324.5430.271×10422.0824.621×10517.5821.59

2.2 IAV和IBV的極速熱循環(huán)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

根據(jù)所得IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)值與其對應(yīng)的平均Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，極速熱循環(huán)熒光定量PCR檢測IAV和IBV質(zhì)粒的線性范圍是10～10copies/μL。通過IBM SPSS Statistic 22作線性回歸分析，IAV標(biāo)準(zhǔn)曲線的

R

=0.990 5，擴增效率為105%；IBV標(biāo)準(zhǔn)曲線的

R

=0.986 5，擴增效率為99.42%。建立的極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)有6個數(shù)量級的線性檢測范圍。

2.3 重現(xiàn)性評價

如圖3，IAV和IBV樣本變異系數(shù)分別為4.74%和1.94%，均<5%，檢測性能穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

圖3 極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測IAV(A)和IBV(B)臨床樣本的重現(xiàn)性

2.4 臨床評價

見圖4和表3可知，以傳統(tǒng)RT-qPCR法根據(jù)《軍隊急性呼吸道傳染病病原監(jiān)測方案(2019修訂版)》方案作為對比方法，極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測流感臨床樣本敏感度分別為92.57%，特異度均為100%；陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為88.79%。

表3 兩種方法檢測流感臨床樣本結(jié)果 (例)

傳統(tǒng)RT-qPCR檢測結(jié)果極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測結(jié)果陽性陰性合計陽性1620162陰性13103116合計175103278

圖4 傳統(tǒng)RT-qPCR法檢測臨床樣本擴增曲線

2.5 交叉反應(yīng)評價

在IAV、IBV混合樣本和陰性樣本中均加入

S.aureu

、

H.

influenzae

、

S.

pneumoniae

、RSVB后進(jìn)行檢測。其中IAV和IBV混合樣本中兩種病原體互不干擾，均檢出為陽性，

S.aureu

、

H.

influenzae

、

S.

pneumoniae

、RSVB均為陰性，陰性樣本檢出為陰性，IAV和IBV之間及與其他多種病原體之間無交叉反應(yīng)(見表4)。

表4 極速熱循環(huán)實時定量實時熒光定量PCR檢測流感病毒的交叉反應(yīng)實驗結(jié)果

病原體IAVIBVS. aureuH. influenzaeS. pneumoniaeRSVBIAV+-----IBV-+----陰性樣本------

2.6 抗干擾評價

鼻/咽拭子樣本中可能存在的干擾物質(zhì)有血液、分泌物或抗生素等?？垢蓴_實驗結(jié)果表明，30 g/dL血紅蛋白、3.2 g/dL甘油三酯和100 μg/mL頭孢曲松對流感病毒檢測無干擾(見表5)。

表5 極速熱循環(huán)實時定量實時熒光定量PCR測定流感病毒的抗干擾實驗結(jié)果

30 g/dL血紅蛋白3.2 g/dL甘油三酯100 μg/mL頭孢曲松樣本編號臨床確診結(jié)果重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)341IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+IAV+88IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+IBV+139陰性樣本---------

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)與傳統(tǒng)RT-qPCR相比，極速熱循環(huán)兩種方法的陽性符合率為92.57%(95%

CI

：92.39%～92.75%)；陰性符合率為100%；總符合率為95.32%(95%

CI

：95.29%～95.35%)；檢測流感臨床樣本

Kappa

=0.902(95%

CI

：0.851～0.953)，說明兩種方法檢測結(jié)果具有高度的一致性。由圖5可知，兩種方法檢測相同樣品Ct值變化趨勢一致。

圖5 兩種方法檢測IAV(A)和IBV(B)臨床樣本的線性擬合

3 討論

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，核酸診斷已在臨床中廣泛應(yīng)用。由于呼吸道傳染病傳播范圍廣、傳播速度快及新發(fā)傳染病的多發(fā)，現(xiàn)場快速檢測的需求極速增長。因此，快速高效地檢出呼吸道病原體對于臨床應(yīng)用、挽救人類生命健康和阻止疾病擴散具有重要意義。目前，已有基于快速檢測呼吸道病原體的POCT開發(fā)出來。并有研究證明POCT在診療過程中能更快地實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，提升了流感等呼吸道疾病的治療水平。

隨著分子技術(shù)的飛速發(fā)展，為滿足生物醫(yī)學(xué)檢測的需要，當(dāng)前實時熒光定量PCR儀向高通量、多通道、超高速POCT方向發(fā)展。流行性感冒作為常見的呼吸道感染疾病，且2021年流行性感冒全國發(fā)病率相較于2020年呈上升趨勢，選用IAV、IBV作為實驗研究對象具有重要的臨床意義。本研究采用極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測IAV和IBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限為1×10copies/μL，線性范圍為6個數(shù)量級(1×10～1×10copies/μL)，IAV和IBV標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.990 5和0.986 5，已達(dá)到實時熒光定量PCR水平。鑒于10～10copies/μL包含了兒童、成人和老人流感患者流感病毒載量范圍，故選擇6個低濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。臨床樣本對比試驗表明極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測IAV和IBV臨床樣本敏感度為92.57%，特異度均為100%，陰、陽性預(yù)測值分別為88.79%和100%，變異系數(shù)均<5%，重現(xiàn)性較好，兩種流感病毒之間及兩種流感病毒與其他多種病原體之間無交叉反應(yīng)，且30 g/dL血紅蛋白、3.2 g/dL甘油三酯和100 μg/mL頭孢曲松不干擾檢測結(jié)果。

極速熱循環(huán)實時熒光定量PCR系統(tǒng)利用免核酸提取技術(shù)和極速熱循環(huán)加熱器，檢測時間由傳統(tǒng)RT-qPCR法的2.5 h縮短為0.5 h，樣品用量由50 μL減少至5 μL。同時與傳統(tǒng)RT-qPCR法比較，該系統(tǒng)體積小重量輕并能在現(xiàn)場環(huán)境實施快速檢測，具有高通量特性，能同時完成IAV和IBV等4種呼吸道病原體同步檢測。本研究存在不足之處：①臨床樣本來源于一個單位，可能不具有廣泛代表性。②未制定臨床樣本的統(tǒng)一入選標(biāo)準(zhǔn)，多為2016-2018年的老樣本，缺少近期的新臨床樣本。③此系統(tǒng)采用核酸擴增檢測的方法，存在假陰性，這會造成一定的漏診現(xiàn)象，為避免漏診造成流感防控的漏洞，需要結(jié)合患者臨床癥狀和實驗室其他檢測指標(biāo)對病情進(jìn)行分析。

綜上所述，本研究表明極速熱循環(huán)熒光定量PCR系統(tǒng)的最低檢出限、重現(xiàn)性、特異度與靈敏度等主要性能指標(biāo)達(dá)到了常規(guī)實時熒光定量PCR水平，同時能實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。有望成為一種性能優(yōu)良的呼吸道病原體快速檢測POCT裝置。