劉曉輝，郎洪彥，譚成成，張鵬舉，王偉霞，樸慶林，李信濤

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物生物技術(shù)研究所，吉林 公主嶺 136100）

吉林馬是利用引進(jìn)前蘇聯(lián)重型馬（阿爾登、蘇重挽、弗拉基米爾等）和輕型馬（頓河、蘇高血、卡巴金等）與本地馬雜交改良，經(jīng)過28年的聯(lián)合育種，于1978年成功培育出的挽乘兼用型和重挽型馬的新品種［1］。馬人工授精技術(shù)在中國始于20世紀(jì)30年代，具有加速品種改良、提高種馬利用效率、減少疾病傳播和提高經(jīng)濟(jì)效益等優(yōu)點［2］。馬產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)的國家利用精液低溫保存和冷凍保存技術(shù)達(dá)到高效利用種公馬、跨地區(qū)進(jìn)行品種改良的目的［3］。近年來，隨著中國馬肉、酸馬奶等特色產(chǎn)業(yè)市場需求增大，馬產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展［4-6］，但馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中存在種公馬新鮮精液保存時間短、冷凍精液受胎率低等問題。目前，仍然主要依靠自然交配及鮮精人工輸精完成配種工作。精液體外保存時間過短，限制了良種公馬種質(zhì)資源的輻射范圍。采用低溫保存新鮮精液不僅可以有效避免種公馬精液的浪費，提高種公馬的使用效率，還可以代替冷凍精液在一定范圍內(nèi)實現(xiàn)跨區(qū)域品種改良［7］。

精液的低溫保存是將稀釋后的精液保存在0? 5℃，可保存數(shù)天而不喪失受精能力。其原理是利用低溫來抑制精子活動，降低精子代謝和運動所需的能量消耗。低溫條件下還可以抑制有害物質(zhì)的生長，延長精子的存活時間。當(dāng)溫度回升后，精子又逐漸恢復(fù)正常代謝機能而不喪失受精能力。低溫保存的新鮮精液可以提高優(yōu)良種公馬的利用率，加速品種改良進(jìn)程［8］。

本試驗對吉林馬精液在低溫（4℃）保存下精子運動特性變化開展研究，并對人工授精后母馬情期受胎率進(jìn)行試驗，以期為后續(xù)更深入提高吉林馬種公馬科學(xué)合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

種公馬來自吉林省松原市欣興牧業(yè)馬場。選擇4匹4?12歲成年種公馬，要求體格健康無疾病，繁殖性能良好為試驗用馬，按《種公馬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（DBN654000/T216—2015）要求方法飼養(yǎng)。采精時間為每年4—7月，每匹種公馬每周采精2次。選擇吉林馬母馬150匹，母馬年齡為4?10歲，體格健康無繁殖疾病，發(fā)情周期正常，每天保證充足的飼草、飲水和光照。

1.2 主要試劑及儀器

果糖、Tris、檸檬酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司，青霉素和鏈霉素為獸用商店購買，卵黃液為實驗室自備。

離心機（型號為TDL80-2D），購自上海安亭科技儀器廠；鼓風(fēng)干燥箱（型號為PH-140A），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；邁朗全自動精子分析儀（型號為ML-210JZ），購自南寧松景天倫生物科技有限公司；一次性輸精管（廣西蔣氏動物用品有限公司）、一次性子宮角輸精管（上?？ㄌK生物科技有限公司）。

1.3 精液制備

1.3.1 馬精液稀釋液的配制準(zhǔn)確稱取Tris 3.028g、檸檬酸1.692 g、果糖1.25 g，加入去離子水充分溶解，煮沸室溫冷卻后，4℃保存。酒精棉球擦拭蛋殼表面消毒，去除蛋清，刺破卵黃膜，收集卵黃液體?；A(chǔ)液40 mL+卵黃液10 mL+雙抗配制成馬精液稀釋液，置于37℃水浴鍋中備用。

1.3.2 精液的采集和處理采精時，用溫水清洗種公馬陰莖，挑選性情溫順的發(fā)情母馬作臺馬或使用假臺馬。采精人員安裝好假陰道，固定好集精杯，通過注水口灌注40℃左右的溫水，檢查密閉性，采精時保證水溫為38?40℃。待公馬爬跨時，采精人員迅速站到臺馬右后側(cè)，將陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)完成采精。采精后，將集精杯緩緩向下傾斜，打開放氣閥門，取下集精杯，迅速送至精液處理室，用滅菌紗布過濾精液并統(tǒng)計采精量。原精顏色為不透明乳白色，無異常氣味，精子活力達(dá)到0.6以上，密度在1.0×109個/mL左右的精液才能使用。

1.3.3 精液的稀釋和保存將采集的新鮮精液用稀釋液進(jìn)行1∶1稀釋，室溫條件下2 000 r/min離心10min棄去上清液，添加38℃的稀釋液，輕輕搖勻，分裝于15 mL離心管中。留當(dāng)天用于人工授精的精液，其余精液用脫脂棉或紗布纏裹置于低溫（4℃）下保存，每隔12 h輕輕混勻精液1次。

1.4 精子運動參數(shù)檢測

在24、48、72、96、120 h時將保存的精液于38℃水浴中復(fù)蘇3 min，然后用全自動精子分析儀檢測精子總活力、直線前進(jìn)活力、平均運動速率。在檢測腔室中隨機選取3個不同視野，每個視野精子數(shù)量不少于300個精子，每次重復(fù)檢驗3次，試驗重復(fù)5次。

1.5 人工授精

通過直腸檢查法檢測母馬發(fā)情狀況，每天進(jìn)行1次發(fā)情排卵鑒定。由熟練掌握輸精技術(shù)人員進(jìn)行人工輸精，所有人工授精試驗中使用的精液體積為10 mL。母馬每次人工授精使用的精液來自單匹種公馬，不得使用混合精液，記錄每次輸精時間、母馬及對應(yīng)的種公馬編號等信息。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫（4℃）下不同保存時間對吉林馬精子活力的影響

由圖1可知，4℃保存的吉林馬運動精子活力分別為從0 h的88.7%下降到120 h的40.3%；前向運動精子活力從0 h的78.3%下降到120 h的31.8%；保存24、48和72 h的精子平均路徑速度及快速運動精子活力與0 h相比差異不顯著（P＞0.05），而保存96 h和120 h的精子平均路徑速度及快速運動精子活力與0 h相比差異顯著（P＜0.05）。

圖1 低溫（4℃）保存不同時間吉林馬精子運動特性統(tǒng)計結(jié)果

2.2 低溫（4℃）下不同保存時間對吉林馬人工授精情期受胎率的影響

由表1可知，4℃下保存0、24、48、72、96、120 h的吉林馬精子，人工授精后母馬情期受胎率分別為43.33%、44.00%、44.45%、43.48%、20.00%和10.00%。精子4℃下保存24、48和72 h時母馬情期受胎率與0 h差異不顯著（P＞0.05），但保存96 h和120 h母馬情期受胎率與0、24、48、72 h差異顯著（P＜0.05）。

表1 吉林馬母馬人工授精情期受胎率

3 討論

隨著低溫保存時間的增加，精子形態(tài)發(fā)生改變［9，10］，畸形率會顯著增加［11］。溫度變化引起的畸形休克可能導(dǎo)致精子膜損傷，活力、DNA完整性、活性氧類產(chǎn)生和頂體的變化，從而降低精子的存活率和受精能力。關(guān)于精子低溫保存過程中運動能力的下降在牛［12］、羊［13］、豬［14］、驢［15］、雞［16］等動物的相關(guān)研究已有報道。在低溫保存前將精液進(jìn)行稀釋可以減少精子受到損傷從而延長精子存活時間。理想的稀釋液是保障低溫保存效果和人工授精技術(shù)順利實施的關(guān)鍵。精液稀釋液含有糖類、緩沖物質(zhì)、抗冷凍劑等物質(zhì)，糖類可為精子存活和維持運動能力提供能量，維持精子質(zhì)膜穩(wěn)定性。緩沖物質(zhì)可防止精液pH發(fā)生巨變，維持酸堿平衡，穩(wěn)定精子的生存環(huán)境，防止精子因酸性過強而死亡。結(jié)果表明，使用檸檬酸-果糖-Tris-甘油-卵黃為稀釋液，低溫保存24、48和72 h，吉林馬精子活力和情期受胎率差異不顯著（P＞0.05），該稀釋液可以用于馬精液的低溫保存，在生產(chǎn)中可以推廣應(yīng)用。

人工授精技術(shù)是影響馬情期受胎率的重要因素。準(zhǔn)確掌握母馬發(fā)情排卵時間，做到適時輸精，是提高受胎率的重要環(huán)節(jié)。此外，輸精方式及一次輸精輸入的有效精子數(shù)量也是影響母馬受胎率的重要因素。精子和卵子結(jié)合完成授精的部位是輸卵管的壺腹部，輸入子宮的精子需要一定的時間才能到達(dá)輸卵管壺腹部。研究表明，驢人工授精輸入精液體積10?15 mL，有效精子數(shù)量6億?8億個的情期受胎率顯著高于2億個。同時，Oliveria等［17，18］研究了冷凍精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，子宮體輸精方式情期受胎率為0%，而子宮角輸精方式情期受胎率為28.26%。楊莉等［19］研究了新鮮精液不同輸精方式對母驢情期受胎率的影響，子宮體輸精方式情期受胎率為33.33%，而子宮角輸精方式情期受胎率為45.16%。付靜濤等［20］研究了常規(guī)輸精和深部輸精對馬情期受胎率的影響，子宮角深部輸精情期受胎率為65.72%，而子宮體常規(guī)輸精情期受胎率為56.13%。說明子宮角深部輸精能顯著提高母馬情期受胎率，可能是由于精子到達(dá)輸卵管壺腹部需要消耗大量的能量，子宮角深部輸精縮短了精子的運動距離，降低了能量消耗，從而能夠提高母馬的受胎率。本研究表明精子低溫保存時間越長，其平均運動速率下降，人工授精后母馬的情期受胎率顯著下降。人工授精輸精方式及一次輸精的有效精子數(shù)量對母馬的情期受胎率有很大影響，但關(guān)于低溫保存的精子與不同輸精方式及有效精子數(shù)量對情期受胎率的影響還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

吉林馬精液低溫（4℃）保存會降低精子的運動性能，隨著時間的延長吉林馬精子的活力會逐漸降低，進(jìn)而導(dǎo)致受胎率的下降。在實際生產(chǎn)中，吉林馬精液低溫（4℃）保存不超過72 h，人工授精后對母馬情期受胎率影響較小，對吉林馬乃至整個馬業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。