黑水雞棘口吸蟲病的臨床案例與病原分子生物學(xué)鑒定

黃瀟航 彭佳佳 陳 榕 李詩藝 張 龍 賀金峪 王詩晨 李金澤 黃 瑜 黃志堅 殷光文*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州，350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福州，350002；3.福建省畜牧獸醫(yī)研究所，福州，350013)

黑水雞(Gallinulachloropus)通體黑褐色，嘴黃色，嘴基與額甲紅色，兩脅具寬闊的白色縱紋，尾下覆羽兩側(cè)為白色，中間黑色，腳黃綠色，腳上部有一鮮紅色環(huán)帶[1]，是具有重要科研、觀賞和經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值的涉禽。黑水雞的人工繁育工作在我國部分地區(qū)已經(jīng)嘗試開展，研究其寄生蟲寄生和感染情況，對保護(hù)和開發(fā)黑水雞資源具有重要意義。

棘口吸蟲(Echinostomaspp.)是一類寄生于水禽體內(nèi)的常見消化道吸蟲。生活發(fā)育過程經(jīng)歷卵、毛蚴、胞蚴、母雷蚴、子雷蚴和囊蚴等階段，淡水螺、蛙和淡水魚等均是其重要的中間宿主，主要致病機(jī)理為棘口吸蟲的吸附結(jié)構(gòu)刺激禽類腸道黏膜，導(dǎo)致禽類患腸炎，營養(yǎng)被剝奪，同時由于其分泌毒素，容易造成禽類消化機(jī)能發(fā)生障礙，使禽類生長發(fā)育受阻等[1]。分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲種類鑒定中的應(yīng)用越來越廣泛，COXⅠ、18S rRNA等也被更多地運用在寄生蟲的分子鑒定中。核糖體間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS在絳蟲、線蟲和吸蟲等多類蠕蟲的遺傳研究中應(yīng)用較廣，被學(xué)者認(rèn)為是一種較好的基因分子標(biāo)記。

本研究對福建省某地送檢的1例自然死亡黑水雞進(jìn)行吸蟲完全剖檢法檢測，結(jié)合傳統(tǒng)寄生蟲檢測和病理學(xué)研究等，通過分子生物技術(shù)鑒定分離獲得的蟲株，旨在為黑水雞人工繁育馴化中寄生蟲病的防控提供相關(guān)參考。

1 病例簡介

福建省某地送檢的自然死亡黑水雞，雄性，2019年11月送檢時體表毛色暗淡，泄殖腔附近有大量排泄物粘附于肛周羽毛，形體輕度消瘦，口腔黏膜輕度發(fā)白，無異常分泌物(圖1)，懷疑患消化道寄生蟲病。

圖1 黑水雞尸體外觀Fig.1 The appearance of the dead Gallinula chloropus

2 材料與方法

臨床解剖，觀察內(nèi)臟器官有無病理變化。采集有臨床病變的主要部位，浸泡于10%福爾馬林溶液，送往北京康佳宏原生物科技有限公司進(jìn)行病理組織學(xué)切片的制備與觀察。采集蟲體，-20 ℃保存于75%乙醇溶液內(nèi)，用于分子生物學(xué)鑒定。在形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)上，采集1株(HSX-01)形態(tài)較為完整的腸道內(nèi)吸蟲進(jìn)行DNA提取，根據(jù)文獻(xiàn)[2]合成吸蟲通用引物進(jìn)行ITS遺傳區(qū)域的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25.0 μL(TaqMix酶12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，目的基因DNA模板4.0 μL)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。獲得陽性條帶切膠回收后送往福州鉑尚生物公司測序。

下載NCBI中與HSX-01株具有較高同源性的吸蟲序列，構(gòu)建相關(guān)吸蟲進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法采用鄰近樹法，循環(huán)計算1 000次進(jìn)行樹圖的制備。使用肝片吸蟲(Fasciolagigantica，MK321642.1)作外群，序列比對方法采用多序列比對分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 尸體剖檢

臨床解剖死亡黑水雞，發(fā)現(xiàn)主要臟器無明顯病變，肝臟輕微充血腫大，腸道部位發(fā)黑栓塞，輕度鼓氣，胃腸道內(nèi)有大量吸蟲蟲體。參照李國清[3]對吸蟲病的確診標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合臨床消化道病變，初步判斷感染了棘口吸蟲(圖2)。

圖2 黑水雞腸道吸蟲蟲體(↑示蟲體)Fig.2 The fluke(↑) observed in intestinal autopsy

3.2 蟲體形態(tài)學(xué)觀察

從消化道中分離出多條形態(tài)完整和肉眼可見的吸蟲蟲體(圖3A)。蟲體扁平，長為0.65～1.20 cm，具有多個吸盤，頭部膨大為冠狀結(jié)構(gòu)(圖3B)。腸道內(nèi)蟲體寄生部位的腸壁變薄，有出血點。

通過臨床光學(xué)顯微鏡觀察，吸蟲的尾部無小棘(圖3C)，頭冠上有頭棘(圖3D黑色箭頭)，頸部狹長，腹部具有吸盤結(jié)構(gòu)，腸道纖細(xì)，形態(tài)學(xué)特征符合棘口吸蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)[3]。

圖3 黑水雞腸道吸蟲的形態(tài)Fig.3 Morphology of intestinal fluke in Gallinula chloropus

3.3 病理組織觀察

由蘇木精與伊紅染色制備病理HE石蠟切片觀察可知，黑水雞腸黏膜層局部壞死，絨毛結(jié)構(gòu)消失，伴有大量壞死細(xì)胞碎片(圖4A)；心臟組織局部心肌纖維斷裂，纖維溶解伴有炎性細(xì)胞彌散性浸潤(圖4B)；炎性細(xì)胞灶性浸潤，肝血竇擴(kuò)張充血(圖4C)；部分小腸絨毛上皮細(xì)胞脫落壞死，炎性細(xì)胞彌散性浸潤(圖4D)。

圖4 黑水雞病理組織檢查結(jié)果(200×，HE)Fig.4 Histological examination results of Gallinula chloropus(200×，HE)

3.4 分子生物學(xué)鑒定

黑水雞吸蟲ITS擴(kuò)增片段大小為744 bp(圖5)。使用DNAStar 7.0生物分子軟件，參照NCBI中已報道的吸蟲序列進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)域劃分，結(jié)果顯示：同源性登錄序列從高至低依次為Echinostomatrivolvis(GQ463127.1)，E.friedi(AJ564383.1)和E.cap-roni(AJ564382.1)，同源性分別為92.87%、92.73%和92.60%。比較BD引物擴(kuò)增的ITS區(qū)域片段，分析該片段的ITS2遺傳信息，使用DNAStar 7.0軟件，比較獲得的ITS序列與E.trivolvis(GQ463127.1)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得的序列相對保守，同源性均超過90.00%。

圖5 樣品ITS遺傳區(qū)域PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of the ITS genetic region of the sample 注：M.Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1.吸蟲HSX-01的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物 Note：M，Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker.1，The ITS amplified products of fluke HSX-01

借助生物分析軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)黑水雞腸道寄生的棘口吸蟲(HSX-01)在生物分子遺傳上更接近于E.trivolvis(GQ463127.1)，同源性達(dá)92.90%，此外，與其他棘口吸蟲(AJ564383.1、CQ463132.1、KM520150.1、AF336232.1、GQ463127.1、AJ564382.1和MT409012.1)也具有較高的同源性，同源性均大于91.00%。通過同源性比對、樣本株與進(jìn)化樹分析，本次分離獲得HSX-01株吸蟲與棘口吸蟲(AJ56-4383.1、GQ463132.1、KM520150.1、AF336232.1、GQ463127.1、AJ564382.1和MT409012.1)在樹圖上形成單獨的區(qū)域分支，與外屬吸蟲——肝片吸蟲(MK321642.1.1)存在較遠(yuǎn)的樹圖遺傳距離(圖6)。

圖6 黑水雞棘口吸蟲ITS Neighbor-joining進(jìn)化樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed by the sequences of ITS of Echinostoma spp.

4 討論

王麗坤等[4]曾報道丹頂鶴(Grusjaponensis)感染棘口吸蟲的案例；趙國等[5]報道了白腹秧雞(Amaurornisphoenicurus)感染棘口吸蟲，對病理組織學(xué)形態(tài)觀察研究；我國南北方城市均有關(guān)于雞[6]、鴨[7]、鵝[8]，甚至野生哺乳動物如海獅(Zalophuscalifornianus)[9]等感染棘口吸蟲的報道，可見該類吸蟲感染的范圍較廣，存在跨宿主寄生的可能性。

黑水雞作為一種常見的涉禽，主要生活在鄉(xiāng)村水塘、沼澤和灘涂地，主要食物為湖泊和沼澤生態(tài)系統(tǒng)中的魚、蝦和螺等小型水生動物及水生植物，棘口吸蟲常寄生于水生動物體內(nèi)，這也成為黑水雞感染該病的重要食源性途徑。筆者對黑水雞的死亡原因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并確診其為棘口吸蟲感染，通過病理組織學(xué)切片研究其消化道病變，發(fā)現(xiàn)死亡黑水雞腸道表現(xiàn)為炎性灶遷移浸潤，腸道黏膜壞死，腸道絨毛層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損壞，伴隨肝炎、淤血和心肌撕裂等病變，可能與寄生吸蟲破壞腸道結(jié)構(gòu)有關(guān)。我國對黑水雞消化道吸蟲的報道主要停留在形態(tài)學(xué)方面，分子遺傳鑒定較少，本研究通過對ITS遺傳區(qū)間測序和構(gòu)建進(jìn)化樹，為黑水雞消化道吸蟲的種類鑒定提供了重要參考。

徐光輝等[10]報道了棘口吸蟲感染會引起發(fā)燒及肝功能異常的臨床癥狀。在本案例中，被感染的黑水雞除了消化系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥外，心和肝等部位也存在不同程度的炎性病理組織學(xué)變化，可能由于棘口吸蟲感染直接或間接引發(fā)細(xì)菌等微生物感染所致。本案例首次通過分子生物學(xué)技術(shù)對黑水雞棘口吸蟲的種群遺傳學(xué)進(jìn)行深入研究，為黑水雞野生種群棘口吸蟲病的臨床診斷提供了依據(jù)。