結(jié)核分枝桿菌外排泵研究進(jìn)展

張春菁，謝宗會，萬成杰，楊再昌

貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起的結(jié)核病(Tuberculosis，TB)仍然是全球公共衛(wèi)生的主要威脅之一[1]。結(jié)核病的治療受到耐多藥(multidrug-resistant，MDR)和廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)結(jié)核分枝桿菌的影響。Mtb對抗結(jié)核藥物的耐藥性成為抗結(jié)核治療的難題之一[2]。結(jié)核分枝桿菌的耐藥性是由其基因決定的，在藥物選擇壓力下，耐藥菌株成為優(yōu)勢菌。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因有4個，包括靶基因突變、藥物降解、藥物滅活和藥物外排[3]。其原理是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的異常結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞外排泵(efflux pumps，EPs)的過度表達(dá)限制了各類抗生素在細(xì)胞內(nèi)的積累[4]。

外排泵是一種能夠?qū)⑺幬锿馀懦黾?xì)胞膜的蛋白質(zhì)，參與了結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥發(fā)生機(jī)制，降低了藥物在細(xì)菌體內(nèi)的濃度。外排泵在維持細(xì)胞內(nèi)、外物質(zhì)交換和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠識別各種具有廣泛物理和化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，這使得耐藥菌株成為優(yōu)勢菌[2]。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特征和生物能量學(xué)，外排泵被分為初級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和次級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。初級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是利用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)水解產(chǎn)生的能量輸出底物，主要為ATP結(jié)合盒超家族(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5]；次級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由跨膜離子梯度中捕獲的電化學(xué)能量驅(qū)動底物運(yùn)輸，次級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐受小節(jié)分裂區(qū)家族(resistance-nodulation-division，RND)、小耐多藥性家族(small multidrug resistance，SMR)、多藥和有毒化合物排出家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)、藥物/代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(drug/metabolite transporter, DMT)家族[5]。

Mtb含有大量的藥物外排泵基因，目前已在Mtb中發(fā)現(xiàn)了MFS、ABC、RND和SMR家族的外排泵[2]。本綜述對結(jié)核分枝桿菌的上述外排泵家族的結(jié)構(gòu)、功能以及外排泵抑制劑相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，希望對結(jié)核病的治療有所幫助。

1 ABC外排泵

1.1 ABC外排泵結(jié)構(gòu)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在原核生物和真核生物中均有發(fā)現(xiàn)，并構(gòu)成了大量的多亞基通透酶超家族，它們可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、抗生素和多糖[6]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是已知最大的外排泵超家族，編碼2.5%的Mtb基因組，是一組具有通道結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)ATP結(jié)合位點(diǎn)的跨膜蛋白。P-糖蛋白是該家族中最具代表性的外排泵，具體如圖1[2]所示。P-糖蛋白由2個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD)TMD1和TMD2、2個核苷酸結(jié)合區(qū)(nucleotide-binding domain, NBD)NBD1和NBD2[2]組成。TMD含有6個疏水α螺旋，形成底物識別位點(diǎn)和運(yùn)輸管道。DrrABC復(fù)合體(Rv2936/2937/2938)是結(jié)核分枝桿菌ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一。DrrA包含2個NBD，DrrB包含6個α螺旋，其結(jié)構(gòu)和功能與P-糖蛋白同源[2]。

圖1 結(jié)核分枝桿菌中ABC、RND、MFS、SMR外排泵系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

1.2 結(jié)核分枝桿菌ABC外排泵的功能

在結(jié)核分枝桿菌中已鑒定出一些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如Rv0194、Rv1218c、DrrAB、Rv2688c、PstB、Rv1218c、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c和Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c、Rv1473，它們可以轉(zhuǎn)運(yùn)不同的底物。Rv0194可以轉(zhuǎn)運(yùn)氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素、新生霉素、乙錠等藥物，Rv0194輸出脂質(zhì)與Rv0194表達(dá)菌株耐藥性增加有關(guān)，外膜中大量的特定脂質(zhì)可能會減少抗生素的攝取，從而間接引起分枝桿菌耐藥[7]；Rv1218c能夠轉(zhuǎn)運(yùn)吡啶酮、聯(lián)芳基-哌嗪、聯(lián)氨基苯并嘧啶、吡咯等藥物[8]；DrrAB能夠轉(zhuǎn)運(yùn)阿霉素、溴化乙錠等藥物，該泵將親脂性代謝物或疏水性化合物輸出到細(xì)胞外部，在抵抗疏水性藥物方面發(fā)揮作用[9]。DrrAB、PstB與氟喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)[10]，磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體Pst在多種微生物中被發(fā)現(xiàn)，主要參與磷酸鹽運(yùn)輸，胞內(nèi)氟喹諾酮外排也與其有關(guān)。PstB是Pst系統(tǒng)中的核苷酸結(jié)合亞基，含有ATP酶的活性。PstB基因突變導(dǎo)致PstB對磷酸鹽的攝取量提高，而PstB失活將使其喪失對磷酸鹽的高度親和力，導(dǎo)致菌株對氟喹諾酮非常敏感?！胺Z酮類藥物輸出ATP結(jié)合蛋白Rv2688c(fluoroquinolones export ATP-binding protein，F(xiàn)EAB)”屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，參與氟喹諾酮外排。FEAB使藥物分子從Mtb的細(xì)胞質(zhì)中流出，與Rv2686c、Rv2687c結(jié)合并與FEAB的終止密碼子形成操縱子。ATP與FEAB結(jié)合，形成二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)并釋放能量。釋放的能量負(fù)責(zé)將底物和藥物分子從細(xì)胞質(zhì)外排到細(xì)胞外間隙[5]。FEAB操縱子的過度表達(dá)賦予了結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星、諾氟沙星和鏈霉素的耐藥性[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c參與了無機(jī)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，其mRNA過表達(dá)與結(jié)核桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性有關(guān)[11]。Rv1473是一種新型ATP結(jié)合盒外排泵，Rv1473與ctpD跨膜蛋白協(xié)同作用，導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類化合物從細(xì)胞質(zhì)流出細(xì)胞外。這一發(fā)現(xiàn)將有助于研發(fā)抑制結(jié)核分枝桿菌的新型抗生素[12]。

1.3 ABC外排泵運(yùn)輸機(jī)制

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸機(jī)制是一種“交替進(jìn)入”機(jī)制，該機(jī)制使構(gòu)象狀態(tài)在向內(nèi)開放、閉塞和向外開放之間切換，從而使底物跨膜轉(zhuǎn)移(見圖2)[13]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的TMD包含底物結(jié)合口袋和NBD，通過結(jié)合并水解ATP以驅(qū)動轉(zhuǎn)運(yùn)。構(gòu)象變化與NBD的二聚化和解離有關(guān)，這種二聚化和解離是由ATP的結(jié)合和水解介導(dǎo)的[13]。

圖2 ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

2 MFS外排泵

2.1 MFS外排泵結(jié)構(gòu)

MFS外排泵是二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中最大的一類，是一組跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可與滲透離子梯度響應(yīng)，促進(jìn)目標(biāo)底物的跨膜轉(zhuǎn)移[1]。特征明確的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有一個共同的α螺旋折疊，并且可通過單向、共向或反向轉(zhuǎn)運(yùn)來運(yùn)輸多種底物。Du等[14]報道，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv中鑒定了30種MFS蛋白；大多數(shù)MFS成員的長度為400～600個氨基酸殘基，并具有12或14個反式跨膜螺旋。在MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中鑒定出幾種保守的氨基酸序列，大多數(shù)MFS蛋白的結(jié)構(gòu)特征為基序A(GrLaDrfGrRRv)、基序B(LvaaRvlQGxGA)和基序C(gxxxGPxxGGxl)[1]。除了類似的初級序列基序外，MFS成員在二級結(jié)構(gòu)上也有相似之處(見圖1)，其特征是共有12個跨膜片段，氨基端和羧基端均位于細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，同時還發(fā)現(xiàn)含有非典型跨膜片段的MFS蛋白[1]。典型的12-TMS MFS蛋白的結(jié)構(gòu)被組織成2個結(jié)構(gòu)對稱的束，每一束由6個連續(xù)的TMS組成，TMS1～6位于N端結(jié)構(gòu)域，TMS 7～12位于C端結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)為由內(nèi)腔分離的雙重偽對稱測量[15]。漏斗結(jié)構(gòu)的空腔形成了底物易位的途徑，沿空腔排列的親水和疏水殘基在易位過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。

2.2 結(jié)核分枝桿菌MFS外排泵的功能

在分枝桿菌中，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能與結(jié)核桿菌耐藥密切相關(guān)。結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中有30種MFS蛋白，MFS蛋白可分為9個亞家族：糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rv2209，Rv3331)、唾液酸鹽H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rv1902c)、陰陽離子交換家族(Rv1672c)、藥物H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Rv0191，Rv0849，Rv2456c，Rv0037c，Rv0842，Rv0876c，Rv1258c)、未知主要易化子家族1(Rv2508c)、藥物H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Rv0783c，Rv1250，Rv1410c，Rv1634，Rv1877，Rv2333c，Rv2459，Rv2846c，Rv3239c，Rv3728)、未知主要易化子家族10(Rv2265)、H+代謝物共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rv1200，Rv3476c)、硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Rv0261c，Rv0267，Rv1737c，Rv2329c，Rv2994)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Rv1410C基因編碼的P55蛋白屬于MFS家族的多藥泵，與鏈霉素和四環(huán)素耐藥性有關(guān)[16-17]，P55蛋白利用跨膜質(zhì)子梯度中的能量來驅(qū)動抗生素的轉(zhuǎn)運(yùn)。氯霉素可以抑制核糖體的蛋白質(zhì)合成并阻止翻譯，Li等[18]研究證明了Rv0191是結(jié)核分枝桿菌對氯霉素產(chǎn)生耐藥性的主要貢獻(xiàn)者；當(dāng)Rv0191過表達(dá)時會導(dǎo)致吡嗪酰胺對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性[19]。Rv0037c、Rv0842、Rv0876c、Rv2209、Rv2459、Rv1250、Rv1258c、Rv2459等外排泵基因與利福平的耐藥性有關(guān)，在利福平單抗結(jié)核分枝桿菌中被利福平誘導(dǎo)過度表達(dá)[20]。

2.3 MFS外排泵運(yùn)輸機(jī)制

MFS成員可以根據(jù)動力學(xué)機(jī)制分為單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征是單一底物沿濃度梯度移動；而同向轉(zhuǎn)運(yùn)和反向轉(zhuǎn)運(yùn)分別由溶質(zhì)轉(zhuǎn)移方向相同和相反的電化學(xué)梯度驅(qū)動[1]。Huang等[21]提出了交替存取模型中的搖桿開關(guān)機(jī)制，該模型研究顯示，MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)體通過N和C結(jié)構(gòu)域的剛性轉(zhuǎn)動，經(jīng)歷向內(nèi)、向外和中間封閉狀態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在搖桿開關(guān)模型的底物/質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)的流入過程中，質(zhì)子可能會在底物與轉(zhuǎn)運(yùn)體識別之前與轉(zhuǎn)運(yùn)體N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)的某些谷氨酸鹽結(jié)合，質(zhì)子化轉(zhuǎn)運(yùn)體對隨后上傳的底物顯示出更高的親和力，并且降低了向外和向內(nèi)相互轉(zhuǎn)換所需的能量值，從而引起向外到向內(nèi)轉(zhuǎn)變，這得益于保守鹽橋相互作用的形成和中心腔內(nèi)靜電環(huán)境的改變[21]。在此過程中，位于中心空腔中的底物結(jié)合位點(diǎn)交替暴露于膜的一側(cè)，以防止底物泄漏，且發(fā)現(xiàn)位于底物結(jié)合位點(diǎn)中的不同氨基酸殘基決定了底物特異性。值得注意的是，底物轉(zhuǎn)運(yùn)孔的疏水或親水性質(zhì)與特定底物一致，這可能會有利于底物結(jié)合，如EmrD的疏水空腔和FucP 的兩親空腔在向內(nèi)取向的確認(rèn)中，底物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，伴隨著氫鍵的斷裂和形成，以及隨后的去質(zhì)子化和構(gòu)象重排以完成循環(huán)(見圖3)[1]。

圖3 MFS外排泵底物/質(zhì)子同向體構(gòu)象變化

3 RND外排泵

RND是一個無處不在的外排泵家族，其成員來自細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物[3]。它們能夠識別和調(diào)節(jié)多種底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過質(zhì)子動力逆轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制介導(dǎo)底物轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.1 RND外排泵結(jié)構(gòu)

RND蛋白形成同源三聚體或異源三聚體[13]，每個單體含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個可溶性細(xì)胞質(zhì)外環(huán)。細(xì)菌中的RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常由3種不同蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)組成，它們連接著內(nèi)膜和外膜，形成穿過2個膜的連續(xù)通道。普遍存在的RND超家族還包括具有不同4級結(jié)構(gòu)的成員，如參與膽固醇穩(wěn)態(tài)的單體真核生物C型1類尼曼-匹克蛋白(Niemann-Pick C1，NPC 1)[22]，作為蛋白質(zhì)輸出復(fù)合體一部分的異二聚體SecD3[23]，以及將分子運(yùn)送到外膜的同源二聚體HpnN[24]。迄今為止，5個可用的RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)(即AcrB、CusA、MexB、ZneA和MtrD)揭示了同源三聚體，其中每個單體均帶有12個跨膜螺旋(TM)，分別在TM1和TM2之間以及TM7和TM8之間插入N-端和C-端周質(zhì)結(jié)構(gòu)域(見圖4)[25]。RND轉(zhuǎn)運(yùn)體膜蛋白拓?fù)渚哂?個周質(zhì)結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域包含2個轉(zhuǎn)運(yùn)子結(jié)構(gòu)域和1個對接子結(jié)構(gòu)域，在TM6和TM7之間有一個額外的胞漿螺旋，位于細(xì)胞質(zhì)膜表面附近[25]。

圖4 RND轉(zhuǎn)運(yùn)體膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

3.2 結(jié)核分枝桿菌RND外排泵的功能

結(jié)核分枝桿菌中的RND 蛋白被稱為分枝桿菌膜蛋白大分子(Mycobacterialmembrane protein large，MmpL)，其相對分子質(zhì)量在1.00×105～1.22×105[26]。MmpL家族由13個放線特異性內(nèi)膜蛋白組成，約有 1 000 個殘基。MmpL蛋白不僅在底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要的作用，而且可通過影響抗生素從血漿周圍的流出使結(jié)核分枝桿菌的耐藥性發(fā)生變化[27]。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了 14 個mmpL基因(見表1)[3]。MmpL蛋白家族是結(jié)核分枝桿菌中 RND 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重要組成部分之一，共有 14 個成員，目前已知的是MmpL3、MmpL4、MmpL5、MmpL7、MmpL8 和 MmpL11，還有8個成員須進(jìn)一步探索[3]，MmpL蛋白與介導(dǎo)跨分枝桿菌膜的底物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。在最近幾年中，MmpL3已成為最成功的抗結(jié)核藥物靶標(biāo)[25]，其對于結(jié)核分枝桿菌的生存能力至關(guān)重要[28-29]。MmpL3和MmpL11在海藻糖單霉酸酯(trehalose monomycolate，TMM)、單體木霉二酰甘油(monomeromycolyl diacylglycerol，MMDAG)和霉菌酸酯蠟的輸出中表現(xiàn)出雙重作用，并且均與血紅素的輸入有關(guān)[25]。MmpL5和MmpL7還與藥物外流有關(guān)，參與抗生素外排的第1個MmpL蛋白是MmpL7。結(jié)核分枝桿菌的mmpl7基因在恥垢分枝桿菌中過度表達(dá)時，可賦予其異煙肼耐藥性。MmpL7和MmpL8蛋白被證明能運(yùn)輸聚酮二茂鐵和硫酯蛋白-1[30-33]，MmpL8可將脂質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)膜輸出到結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁。Mtb中的MmpL5蛋白可以從細(xì)胞質(zhì)中吸收霉菌素并將其釋放到周質(zhì)中，因此MmpL5能夠使細(xì)胞質(zhì)中的利奈唑胺和吡嗪酰胺藥物外排至周質(zhì)中[3]。

表1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv中的mmpL基因

4 SMR外排泵

SMR家族蛋白是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的最小的多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，其利用質(zhì)子動力運(yùn)輸毒性季銨鹽化合物[37]。SMR蛋白運(yùn)輸多種疏水底物，包括抗生素和熒光染料[38]。

4.1 SMR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)

SMR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由110個氨基酸組成的小蛋白質(zhì)[39]，只有4個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，但具有同二聚體或異二聚體的功能(見圖1)[13]。SMR家族是14個系統(tǒng)發(fā)育不同的次級活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一，屬于DMT超家族。SMR家族蛋白的長度較短(100～170個氨基酸)，并以4條疏水性α-螺旋跨膜鏈(transmembrane strands，TMS)跨過質(zhì)膜[37]。

4.2 SMR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能

迄今為止，在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的SMR蛋白較少[40]。TBSMR是結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一[41]。來自SMR超家族的次級多藥/質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)核分枝桿菌TBsmr[以前稱為mmr(Rv3065)]由107個氨基酸組成，與大腸桿菌EmrE的序列同源性約為43%，它是結(jié)核分枝桿菌的一種次級活性多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體。有研究表明，在耐異煙肼的結(jié)核分枝桿菌菌株中，mmr過度表達(dá)[42]。

5 結(jié)核分枝桿菌的外排泵抑制劑

外排泵促使活性藥物外排，導(dǎo)致藥物敏感性降低，治療效果變差?？赏ㄟ^改變外排泵的表達(dá)或功能組裝(生物抑制)、使外排泵能源崩潰或耗盡以及與外排泵的直接相互作用(競爭性和非競爭性抑制)3種方式來調(diào)節(jié)外排泵?！巴馀疟靡种苿币辉~被廣泛用于描述通過上述任何一種機(jī)制調(diào)節(jié)外排活性的化合物，而不一定是指與外排泵直接相互作用的抑制劑[4]。理想的治療性外排泵抑制劑應(yīng)該對健康的宿主細(xì)胞顯示有限的毒性，以獲得對靶標(biāo)細(xì)胞或病原體的充分協(xié)同化治療效應(yīng)。這種選擇性毒性可能是通過特異性地抑制其在哺乳動物細(xì)胞中不發(fā)生(或發(fā)生在較低數(shù)量的)的外排泵實(shí)現(xiàn)的。潛在的抗結(jié)核分枝桿菌外排泵藥物可分為2類，即合成藥物和植物提取物藥物。

5.1 合成的外排泵抑制劑

外排泵抑制劑中，合成類藥物有以下幾種：維拉帕米和去甲維拉帕米、質(zhì)子載體羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)、2，4-二硝基苯酚(DNP)等。維拉帕米的藥物靶點(diǎn)為ABC(如DrrAB、PstB、Rv2686c-2687c-2688c)，MFS(如lfrA、Rv1634、Rv1258c、Rv1877、Rv2846c)，RND(如Rv1145、Rv1146、Rv0678)，SMR[如Rv3065(mmr)][2]。有研究證明，使用維拉帕米能夠降低抗結(jié)核藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)[43]，其被報道是迄今為止最有效的分枝桿菌外排泵抑制劑，能夠增強(qiáng)異煙肼和利福平對結(jié)核分枝桿菌臨床菌株的抑制活性[44]。最近的研究表明，維拉帕米促進(jìn)的外排抑制可以增強(qiáng)貝達(dá)喹啉的活性[44]。

Vianna等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在膿腫分枝桿菌中，四氫吡啶衍生物是一種比經(jīng)典抑制劑維拉帕米更有效的外排泵抑制劑。因此，可以把四氫吡啶衍生物推廣應(yīng)用到抗結(jié)核分枝桿菌感染中，并觀察其治療效果。羰基氰間氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)針對的外排泵是：ABC家族的Rv2936-Rv2937(DrrAB)，Rv0933(PstB)，Rv2686c-2687c-2688c；MFS家族的LfrA，Rv2459(jefA)，Rv1410c(P55)，Rv1634，Rv1258c，Rv1410c，Rv1877，Rv2846c；RND家族的Rv1145，Rv1146，Rv0676c-Rv0677c(MmpS5-MmpL5)；SMR家族的Rv3065(mmr)。它的主要作用是降低抗結(jié)核藥物的MIC、降低Mtb對抗結(jié)核藥物的耐藥性、與抗結(jié)核藥物形成協(xié)同作用。2，4-二硝基苯酚(DNP)針對的外排泵包括ABC家族[如Rv2936-Rv2937(DrrAB)、Rv0933(PstB)、Rv2686c-2687c-2688c]和MFS家族(如lfrA、Rv1634、Rv1258c)，它能夠降低抗結(jié)核藥物的MIC[46-48]。

5.2 植物提取的外排泵抑制劑

植物提取的外排泵抑制劑有：利血平、胡椒堿、小檗堿、槲皮素、粉防己堿、金合歡醇、苯堿丙烷[2]。當(dāng)存在利血平、胡椒堿時，Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c過表達(dá)引起的吡嗪酰胺耐藥性被抑制，使得吡嗪酰胺的MIC降低50%[19]。在外排泵中，ABC家族的Rv2936-Rv2937-Rv2938(DrrABC)、Rv0933(PstB)、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c，RND家族的Rv0678、Rv1145、Rv1146、mmpL7，MFS家族的P55、Rv1877、Rv2846c，SMR家族的Rv3065，都是利血平的作用靶點(diǎn)。利血平能夠降低抗結(jié)核藥物的MIC，降低或逆轉(zhuǎn)結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的耐藥性，提高結(jié)核分枝桿菌中抗結(jié)核藥物的濃度[2]。胡椒堿的作用靶點(diǎn)是MFS家族的Rv1258c，它可以降低抗結(jié)核藥物的MIC、上調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答。黃連素能夠抑制多藥細(xì)菌的耐藥性，NorA、RamR是其作用靶點(diǎn)。槲皮素能夠抑制結(jié)核分枝桿菌的生長，其作用靶點(diǎn)是SMR家族的Rv3065(mmr)。粉防己堿能夠降低抗結(jié)核藥物的MIC，與抗結(jié)核藥物有協(xié)同作用，其作用靶點(diǎn)是MFS家族的Rv2459(jefA)、Rv3728，SMR家族的Rv3065(mmr)[49-50]。金合歡醇與抗結(jié)核藥物具有協(xié)同作用，其在外排泵的作用靶點(diǎn)暫時未被測定[51]。苯基丙烷能夠降低抗結(jié)核藥物的MIC，增加抗結(jié)核藥物在結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)的積累，其作用靶點(diǎn)是RND家族的Rv1145、Rv1146，MFS家族的Rv1877、Rv2846c，SMR家族的Rv3065(mmr)[2]。外排泵抑制劑的開發(fā)在臨床上有很大的應(yīng)用前景，與抗菌藥物聯(lián)用將提高結(jié)核病的治愈率。

6 結(jié)語與展望

結(jié)核分枝桿菌能夠形成耐藥性持留細(xì)菌，這是抗生素治療期間的難題。外排泵是細(xì)菌獲得耐藥性的原因之一。目前，在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的外排泵主要有ATP、MFS、RND、SMR四個家族。深入認(rèn)識結(jié)核分枝桿菌外排泵，有助于了解結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，使結(jié)核病的治療更有針對性。在抗結(jié)核分枝桿菌感染中，抗結(jié)核藥物可能會引起外排泵的過度表達(dá)，從而使藥物排到細(xì)胞外，達(dá)不到治療結(jié)核病的效果。因此，在治療結(jié)核病時針對性抑制有關(guān)外排泵的過度表達(dá)，可以阻止有效抗菌藥物的排出。外排泵抑制劑與抗菌藥物聯(lián)用有助于改善目前結(jié)核病的治療狀況。Ramón-García等[48]在其研究中將外排泵抑制劑CCCP與一線抗結(jié)核藥物利福平聯(lián)用，增加了Mtb對利福平的敏感性。外排泵中許多蛋白與疾病相關(guān)，這為治療多耐藥結(jié)核病提供了藥物靶點(diǎn)。通過利用這些靶點(diǎn)，控制底物的運(yùn)輸或基因的表達(dá)，從而影響結(jié)核分枝桿菌在人體內(nèi)的生長，這可能給接受抗結(jié)核治療的多耐藥結(jié)核患者帶來治愈的希望。