楊玉茹，王英英，王 慶，周文禮，尹紀元，石存斌

（1.天津農學院水產學院，天津 300384；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業(yè)農村部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產動物免疫與綠色養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510380）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國最重要的淡水經濟魚類之一，其產量約占全國淡水養(yǎng)殖總量的18%，其產值一直穩(wěn)居我國養(yǎng)殖淡水魚的首位［1］。草魚呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）會引起草魚出血病，近些年大規(guī)模暴發(fā)的草魚出血病嚴重地阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［2-3］。草魚呼腸孤病毒在血清學上尚無系統(tǒng)分類?；诟鞣蛛x株不同基因節(jié)段編碼的氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹表明，我國的GCRV分離株可分為3個基因型，分別是以873為代表的基因Ⅰ型病毒（GCRV-Ⅰ）、以HZ08為代表的基因Ⅱ型病毒（GCRV-Ⅱ）和以HGDRV為代表的基因Ⅲ型病毒（GCRV-Ⅲ）［4-7］。目前，國內流行的GCRV基因型主要為GCRV-Ⅱ，占陽性檢出比例95%以 上［8］。與GCRV-Ⅰ和GCRV-Ⅲ相 比，GCRV-Ⅱ對魚體致病性強，但對細胞敏感性弱，接種常見的魚類細胞均不能產生明顯的細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），且病毒增殖滴度較低［9］，不利于診斷和防控產品的研發(fā)。YANG等［10］建立的草魚鰾組織細胞系（grass carp swim bladder cells，CiSB）對Ⅱ型GCRV敏感，可用于增殖Ⅱ型GCRV的研究。

迄今為止，尚無任何特效藥物可用于草魚出血病的治療，免疫預防是最有效的防控措施［11］。傳統(tǒng)的疫苗主要包括滅活疫苗和減毒疫苗，基因工程疫苗的研究也取得了一定的進展［12］。但已有疫苗研發(fā)是以針對基因Ⅰ型GCRV為主，而針對流行基因Ⅱ型GCRV疫苗研究相對滯后［13］?；诜肿恿餍胁W數據，采用新分離的流行株型進行疫苗制備，是目前防控草魚出血病的關鍵。對草魚細胞和病毒流行株的大規(guī)模培養(yǎng)技術的研究，是草魚出血病疫苗規(guī)?；a的重要基礎［14］。

新型的微載體懸浮培養(yǎng)細胞技術具有單位體積利用率高、參數易控制等優(yōu)點，目前在哺乳動物細胞培養(yǎng)及產物制備領域已經有了較為廣泛的應用，如狂犬病疫苗等已實現工業(yè)化的大規(guī)模生產［15］。在水產動物疫苗研發(fā)中微載體培養(yǎng)技術仍然處于探索階段，CHEN等［16］建立了基于低血清培養(yǎng)的鮭魚屬魚類（Oncorhynchus）胚胎細胞（Chinook salmon embryo cells，CHSE）的大規(guī)模培養(yǎng)體系；王維玲等［17］利用Cephodex微載體對鯽（Carassius auratus）腦組織細胞（gibel carp brain cells，GiCB）和鯉皰疹病毒Ⅱ型（cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2）的規(guī)?；瘲l件進行了探索和優(yōu)化；賈路路等［18］優(yōu)化了大鯢（Andrias davidianus）肌肉細胞（giant salamander muscle cells，GSM）和大鯢虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，GSIV）的Cytodex 3微載體培養(yǎng)體系等。在草魚出血病疫苗規(guī)?；a工藝上，葉雪平等［19-20］利用GT-2微載體分別對草魚的吻端細胞ZC-7901和胚胎細胞CP-80以及草魚呼腸孤病毒的培養(yǎng)條件進行了研究。劉秋鳳等［21］對草魚CIK細胞與草魚呼腸孤病毒在Cephodex結合微載體規(guī)模化培養(yǎng)的工藝條件進行了優(yōu)化，但目前還未見針對流行基因型Ⅱ型GCRV的大規(guī)模細胞培養(yǎng)、疫苗生產的相關研究報導，微載體細胞培養(yǎng)技術在水產疫苗應用上尚未成熟，已有研究都處于初期摸索階段。

本研究利用微載體培養(yǎng)CiSB細胞，并對大規(guī)模培養(yǎng)細胞工藝進行優(yōu)化探索，同時進行Ⅱ型GCRV擴增培養(yǎng)，以期為草魚出血?、蛐虶CRV疫苗的制備和工業(yè)化生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

草魚鰾細胞系（CiSB）由本實驗室建立并保存，其培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃；草魚呼腸孤病毒HN1307株（GCRV HN1307）由本實驗室從患病草魚上分離鑒定并保存［22］。

1.2 主要試劑與儀器

M199培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和胰酶購自美國Gibco公司；125 mL、1 L雙側臂細胞培養(yǎng)瓶購自美國Wheaton公司；底面積75 cm2細胞培養(yǎng)瓶（T-75）購自美國Corning公司；微載體選擇Cytodex 1（GE，美國）；磁力攪拌裝置為Micro-Stir低速磁力攪拌器（Wheaton，美國）；全自動細胞計數儀為Countstar BioTech（艾力特，上海）。

1.2 實驗設計

1.2.1 細胞與病毒培養(yǎng)

將CiSB細胞在T-75培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。接種103拷貝數·μL-1濃度1 mL GCRV HN1307至單層的CiSB細胞中，7 d后收獲病毒，-80℃條件下反復凍融3次，然后在4℃條件下以5 000 r·min-1離心30 min去除細胞碎片。測定病毒拷貝數并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?3］。

1.2.2 微載體預處理

稱量干燥后的微載體并加入硅化過的玻璃瓶中，在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液（HBSS）（50～100 mL·g-1Cytodex 1）在37°條件下水合3 h。膨脹后去上清液，用新鮮的HBSS（30～50 mL·g-1Cytodex 1）洗滌微載體。洗滌后去上清液，加入新鮮的HBSS（30～50 mL·g-1Cytodex 1）在121℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min，置4℃冰箱備用。

1.2.3 最佳起始條件與間歇攪拌方式的確定

取對數生長期的CiSB細胞接種于125mL規(guī)格的雙側壁細胞培養(yǎng)瓶內，按表1中的起始條件與貼壁期間歇攪拌條件進行培養(yǎng)，并于接種后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h時取樣觀察CiSB細胞在微載體上的貼附情況，計算CiSB在Cytodex 1上的貼壁率（貼壁率＝1-未貼壁細胞數／接種細胞數×100%），并繪制不同時間的貼附曲線，以獲得細胞微載體懸浮培養(yǎng)最優(yōu)起始及間歇攪拌方式參數。

表1 貼壁期循環(huán)攪拌參數設置Tab.1 Parameter setting of agitation procedure during cell attachment

1.2.4 最佳胰酶消化參數的確定

用125 mL雙側壁細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，24 h后，在超凈臺中于攪拌狀態(tài)下均勻取5 mL培養(yǎng)物至離心管中，靜置使微載體沉降，吸去上清液并用HBSS清洗2次。在4℃和37℃條件下，分別加入0.25%和0.5%的胰酶進行消化1、3、5 min，分組信息見表2。消化后棄置消化液，加入相同體積含5%FBS的M199培養(yǎng)基。對細胞進行計數并觀察微載體空球率，確定適宜的消化濃度、溫度及時間。

表2 胰酶消化參數Tab.2 Trypsin digestion parameters

1.2.5 最佳細胞接種密度的確定

Cytodex1的用量為2 g·L-1，工作體積為100 mL，細胞初始接種密度分別設置為1×105個·mL-1、2×105個·mL-1、3×105個·mL-1、4×105個·mL-1，將細胞接種于125 mL雙側壁培養(yǎng)瓶中，在28℃培養(yǎng)箱中攪拌懸浮培養(yǎng)（30 r·min-1），每 隔24 h取 樣 觀 察CiSB細 胞 在Cytodex1上的生長情況，繪制細胞生長曲線，確定細胞最佳接種密度。

1.2.6 最佳微載體密度的確定

Cytodex1密度分別設置為1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1，細胞接種密度為2×105個·mL-1，工作體積為100 mL。接種對數生長期細胞后，于培養(yǎng)箱中28℃懸浮培養(yǎng)（30 r·min-1），每 隔24 h取 樣 觀 察CiSB細 胞 在Cytodex1上的生長情況，并進行細胞計數，繪制細胞生長曲線，確定Cytodex 1的最佳用量。

1.2.7 最佳攪拌速度的確定

1.2.8 不同補料方式對懸浮培養(yǎng)的影響

取對數生長期的CiSB細胞接種于125mL雙側壁細胞培養(yǎng)瓶中，接種密度為2×105個·mL-1，初始培養(yǎng)基采用含10%FBS的M199培養(yǎng)基，Cytodex1密度為2 g·L-1，工作體積為100 mL。分別采用分批式培養(yǎng)、接種2 d后每天更換10%培養(yǎng)基和接種3 d后1次性更換50%培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔24 h取樣觀察在Cytodex1上的生長狀況，并進行細胞生長曲線的繪制。

1.2.9 血清維持液對懸浮培養(yǎng)的影響

取對數生長期的CiSB細胞接種于125 mL雙側壁細胞培養(yǎng)瓶中，接種密度為2×105個·mL-1，初始培養(yǎng)基采用含10%FBS的M199，Cytodex1密度為2 g·L-1，工作體積為100 mL。在接種3 d后更換50%培養(yǎng)基并調整血清濃度至含5%、8%、10%、15%FBS的M199，每隔24 h取樣觀察在Cytodex1上的生長狀況，并進行細胞生長曲線的繪制。

1.2.10 1 L懸浮培養(yǎng)擴增工藝

測定125 mL雙側壁培養(yǎng)瓶的細胞濃度，棄去生長液，注入HBSS清洗兩次，加入10 mL 0.5%的胰酶消化，3 min后注入含10% FBS的M199終止消化。1 500 r·min-1離心5min收集細胞，接種至1 L雙側壁培養(yǎng)瓶中并補足體積至500 mL，3 h后補足培養(yǎng)液至1 L。按照125 mL雙側壁培養(yǎng)瓶設定好的培養(yǎng)參數進行擴增培養(yǎng)。

1.2.11 GCRV HN1307株增殖和測定

在培養(yǎng)24 h后，觀察到CiSB在Cytodex 1上長成單層，靜置一段時間待Cytodex1沉降至底雙側壁培養(yǎng)瓶底部，棄去上層培養(yǎng)液，接種10 mLⅡ型GCRV（GCRV HN1307株），15 r·min-1條件下連續(xù)攪拌促進病毒吸附，2 h后換5%FBS的維持液至體積100 mL，以30 r·min-1進行連續(xù)攪拌培養(yǎng)細胞和病毒。同時在T-75培養(yǎng)瓶中僅接種病毒作為貼壁培養(yǎng)的對比。在接種病毒后每隔24 h取細胞培養(yǎng)液1 mL，在-80℃條件下反復凍融3次，用qPCR測定病毒拷貝數［21］；實驗持續(xù)7 d，繪制病毒增殖動態(tài)曲線。

事實上，一般情況下，慎眾，主要還是難在不敢做自己，怕落個不合群、不識相或假清高、假正經之類的名聲，因而討人嫌、招人恨，說到底還是修養(yǎng)不到，私心雜念在作怪。元人王冕，不從權貴，不隨世俗，窮隱村野，唯抱貞心，其《墨梅題圖詩》云：“吾家洗硯池頭樹，朵朵花開淡墨痕。不要人夸顏色好，只留清氣滿乾坤?！?/p>

1.3 數據處理與分析

本研究中所有實驗均重復3次，實驗數據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，細胞密度的差異通過t檢驗來分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 最佳起始條件及間歇攪拌培養(yǎng)條件結果

不同起始條件下培養(yǎng)的CiSB細胞貼壁率如圖1所示，其中A、C、E、F組貼壁率均低于90%，在初始培養(yǎng)體積為100 mL的組別中：C組和E組貼壁率顯著低于其他組（P＜0.05）。在初始培養(yǎng)體積為50 mL的組別中：A組貼壁率相對較低；F組貼壁率達86%；D組貼壁率達92%，但由于靜置時間過長，微載體上細胞貼壁未能均勻分布；B組貼壁率可達96%且貼附均勻，因此選擇B組（50 mL培養(yǎng)體積、靜置30 min）為貼壁期最佳培養(yǎng)條件。

圖1 不同攪拌方式的最大貼壁率Fig.1 Cell attachment efficiency under different stirring m ethods

B組不同貼附時間的細胞貼附率如圖2所示。隨著貼壁時間的延長，細胞貼壁率逐漸上升；且在間歇攪拌2 h后達到平臺期，貼壁率達到96%。因此最佳間歇攪拌時間應為3 h，而后補加培養(yǎng)基至100 mL工作體積進行連續(xù)不間斷攪拌懸浮培養(yǎng)。

圖2 細胞在微載體上的貼附曲線Fig.2 Curve of cell attachment to m icrocarriers

2.2 最佳胰酶消化方式

細胞在微載體上培養(yǎng)1 d后，用不同消化方式所得細胞數如圖3所示。結果顯示，胰酶濃度為0.5%、工作溫度為37℃時消化效果顯著好于胰酶濃度0.25%、工作溫度4℃（P＜0.01）。

圖3 不同消化方式獲得的細胞數Fig.3 Cell number obtained by different digestion m ethods

37℃、0.5%胰酶消化不同時間觀察細胞。在消化1 min后測得細胞濃度為7.3×104個·mL-1，顯微鏡下觀察微載體上仍貼附有大量細胞；消化3 min時細胞濃度達4.1×105個·mL-1，顯微鏡下觀察細胞分散良好，微載體基本為空球狀態(tài)；消化5 min時細胞濃度下降，顯微鏡下觀察部分細胞因消化過度破碎。因此確定含0.02% EDTA的0.5%胰酶37℃下消化3 min是細胞消化的最佳條件。

2.3 細胞接種密度對細胞懸浮培養(yǎng)的影響

當微載體密度為2 g·L-1時，不同初始細胞密度接種后在微載體上生長曲線的結果如圖4所示。初始細胞密度1×105個·mL-1時，單個微載體上分布的細胞少且出現較多微載體空載現象，細胞在接種5 d后仍在緩慢生長，最大細胞密度為9.2×105個·mL-1。以3×105和4×105個·mL-1的細胞密度接種時，最大細胞密度都達到1.7×106個·mL-1，但顯微鏡下觀察到單個微載體上分配的細胞數高，細胞對數生長期提前導致細胞在微載體上出現聚團生長、過早衰亡的現象，第4天大量脫落死亡。當細胞接種密度為2×105個·mL-1時，細胞呈現良好的線性增長；鏡下觀察到細胞可均勻分布于每個微載體表面，接種后5 d達最高收獲濃度1.9×106個·mL-1。因此，確定微載體培養(yǎng)細胞時的最佳接種密度為2×105個·mL-1。

圖4 不同細胞接種密度對微載體培養(yǎng)細胞生長的影響Fig.4 Effects of initial cell density on cell grow th on m icrocarriers

2.4 微載體密度對懸浮培養(yǎng)的影響

不同微載體密度對細胞生長曲線的影響見圖5。在微載體密度較低的情況下，細胞密度隨微載體密度的增加而增大；當微載體為1、2、3 g·L-1時，細胞最大密度分別為8.7×105、1.86×106、1.89×106個·mL-1；在5 g·L-1時，微載體出現大量空載。觀察細胞及培養(yǎng)液狀態(tài)，前48 h無明顯變化。第3天，3和5 g·L-1微載體組的培養(yǎng)液偏黃色，pH值下降，細胞脫落嚴重，而2 g·L-1微載體培養(yǎng)瓶中CiSB細胞覆蓋微載體達95%以上。因此確定最佳微載體濃度為2 g·L-1。

圖5 不同微載體密度對微載體培養(yǎng)細胞生長的影響Fig.5 Effects ofm icrocarrier densities on cell grow th on m icrocarriers

2.5 攪拌速度對CiSB懸浮培養(yǎng)的影響

不同攪拌速度下的細胞生長趨勢如圖6所示。當攪拌速度為15 r·min-1時，細胞生長緩慢，最大細胞濃度為8.8×105個·mL-1；顯微鏡下觀察，細胞在微載體表面生長不均勻且細胞生長有細胞團趨勢。當攪拌速度為30 r·min-1、45 r·min-1時，細胞密度上升較快，最高密度分別達1.86×106個·mL-1和1.88×106個·mL-1，兩者間差異不顯著（P＞0.05）；雖然45 r·min-1較30 r·min-1早1 d到達最大密度，但細胞很快從微載體上大量脫落。攪拌速度為60 r·min-1時細胞密度上升較慢且第4天后細胞從微載體脫落嚴重。綜上結果，確定最佳攪拌速度為30 r·min-1。

圖6 不同攪拌速度細胞生長曲線Fig.6 Cell grow th curves at different stirring speeds

2.6 不同補料方式對CiSB懸浮培養(yǎng)的影響

采用分批式培養(yǎng)、第2天起每天更換10%培養(yǎng)基以及第3天一次性更換50%培養(yǎng)基3種不同補料方式培養(yǎng)細胞，結果如圖7所示。3種補料方式最終所收獲細胞密度并不顯著，分批培養(yǎng)細胞密度最低，收獲濃度為1.86×106個·mL-1。一次性更換50%培養(yǎng)基，細胞收獲濃度達2.01×106個·mL-1，略微優(yōu)于每天更換10%培養(yǎng)基的1.95×106個·mL-1?？紤]到每天進行補料，操作上更加繁瑣，因此選擇第3天一次性更換50%培養(yǎng)基為最優(yōu)補料方式。

圖7 不同補料方式細胞生長曲線Fig.7 Cell grow th curves under different feedingmethods

2.7 血清維持液對CiSB培養(yǎng)的影響

初始時使用含10%FBS的M199培養(yǎng)基，在培養(yǎng)3 d后更換為含5%、8%、10%、15% FBS培養(yǎng)液，細胞生長曲線如圖8所示。在達到細胞最大濃度之前，細胞生長速度隨著FBS濃度增大而變快；但各組間最大細胞濃度無顯著性差異，均在1.98×106個·mL-1上下。但在第5天，FBS濃度增大導致細胞脫落速度變快，培養(yǎng)至第7天時，細胞在含5% FBS的培養(yǎng)液中維持效果相對最好。

圖8 不同血清維持液對細胞生長的影響Fig.8 Effects of FBS concentration on cell grow th

2.8 CiSB細胞在微載體上的生長形態(tài)觀察

在倒置顯微鏡下觀察不同時期CiSB細胞在Cytodex 1上的生長情況，結果顯示CiSB細胞在Cytodex 1上具有良好的貼壁性（圖9）。CiSB細胞接種4 h后，細胞逐漸貼附在Cytodex 1上，每個微載體上細胞數大致為20個；接種1 d后，CiSB細胞在微載體上呈纖維狀并開始緩慢增長；接種3 d后，細胞在微載體上基本長成單層；接種5～7 d，細胞在首層細胞上開始多層生長并且微載體之間出現架橋現象；7 d后，部分細胞從微載體上脫落。

圖9 GiSB細胞在微載體上的生長形態(tài)Fig.9 G row th m orphology of GiSB cells on m icrocarriers

2.9 1 L懸浮培養(yǎng)工藝放大

將CiSB細胞培養(yǎng)體積從100 mL放大至1 L后，細胞生長曲線如圖10所示。放大培養(yǎng)后細胞生長速度與在125 mL雙側壁培養(yǎng)瓶中的生長曲線大體相似，細胞濃度在第5天達到最高值，為1.71×106個·mL-1。

圖10 12 m L和1 L懸浮培養(yǎng)細胞生長曲線Fig.10 Grow th curve of cells in 125 m L and 1 L system

2.10 微載體懸浮培養(yǎng)GCRVⅡ型病毒的增殖動態(tài)

GCRV HN1307在CiSB細胞中的增殖動態(tài)如圖12所示。微載體培養(yǎng)條件下，GCRV感染CiSB細胞2 d后病毒開始緩慢增殖，隨后進入對數生長期，5 d后達到峰值6.2×105拷貝數·μL-1，之后開始下降；作為對照，GCRV HN1307在T-75細胞瓶中培養(yǎng)，第6天達到峰值1.42×105拷貝數·μL-1。

3 討論

WEZEL在1967年使用二乙基乙胺（DEAE）作為微載體創(chuàng)立了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)［24］，目前已經成為了疫苗生產的首選工藝。在眾多的微載體中，Cytodex 1是目前最常用的商用微載體，其固體實心的結構有利于細胞貼壁及病毒的感染。本實驗的研究結果表明，Cytodex 1適合CiSB細胞的貼附生長及增殖。

微載體培養(yǎng)工藝涉及到很多復雜的參數，其初始階段中細胞的貼壁率，是整個培養(yǎng)過程中最重要的影響因素［25］。利用間歇攪拌方式，可以提高細胞的貼壁效率與比率［26］；同時使細胞與微載體在相對小的體系下攪拌培養(yǎng)，可以提高細胞與微載體的接觸機會。本研究中采用50 mL培養(yǎng)、靜置30 min、30 r·min-1攪拌2 min的間歇攪拌方式使細胞貼附均勻；對細胞貼壁時間進行觀察，最終確定間歇攪拌時間為3 h，與王維玲等［16］獲得的35 r·min-1，每靜置30 min攪拌2 min的間歇攪拌條件結果類似。

圖11 GCRV在微載體培養(yǎng)條件下的增殖動態(tài)Fig.11 Proliferation dynam ics of GCRV in m icrocarrier culture system

細胞的存活和生長依賴于接種密度和條件效應，低培養(yǎng)密度會導致低生長速率出現［27］；而最終的細胞產量與微載體密度直接相關。選擇適當的接種比例，可以有效利用微載體，提高細胞產量［28］。本實驗中，以1×105個·mL-1接種時，細胞生長緩慢，無法快速進入對數生長期。以4×105個·mL-1密度接種時，細胞在Cytodex 1上聚團生長，使微載體聚集并沉降到瓶底。在高密度下培養(yǎng)細胞易脫落，造成細胞死亡，死亡細胞的代謝產物又易產生細胞毒性。在一定細胞接種濃度下，低濃度的微載體每cm2的細胞產量與細胞生長能力有關；高濃度微載體的培養(yǎng)中可以得到最大單位表面積細胞產量，但需要頻繁地更換培養(yǎng)基。本研究中，當微載體密度為1 g·L-1時，由于微載體不能提供足夠的表面積，細胞受到嚴重的接觸抑制，生長緩慢。微載體密度為3和5 g·L-1時，后期pH下降迅速，需頻繁更換培養(yǎng)液才能保證細胞正常生長；選擇2 g·L-1滿足了細胞生長所需的貼壁面積，細胞增殖快且培養(yǎng)基消耗量少，對大規(guī)模工業(yè)化細胞培養(yǎng)的成本控制有重要意義。此外，1×105個·mL-1和2 g·L-1的接種比例可以實現大多數研究得到的每個微載體上貼附8～20個細胞可獲得最好生長曲線的效果［29-30］。

培養(yǎng)基作為細胞生長的營養(yǎng)來源，是影響微載體培養(yǎng)最直接的環(huán)境因素。其中血清可以在低細胞密度的條件下促進細胞粘附和生長；但在細胞進入指數生長期后，需要用最低血清既保證細胞生長，同時保持細胞單層狀態(tài)［31-32］。本研究中第3天更換血清濃度為5%時，可使細胞達到最大產量同時保持細胞的穩(wěn)定生長。在補料方式的選擇上，分批培養(yǎng)由于培養(yǎng)過程中營養(yǎng)成分不斷消耗，代謝物累計，因此效果不理想［33-34］；第3天一次性更換50%培養(yǎng)基效果優(yōu)于每天更換10%培養(yǎng)基，可能是由于每天置換10%的補料方式特定時間內更換量少，代謝物更易累積，抑制了細胞進一步增殖所致［35-36］。

微載體擴大培養(yǎng)一般采用消化放大工藝，利用胰酶消化微載體上的細胞并接入更大規(guī)模反應器，補加新微載體和培養(yǎng)基進行新一輪的培養(yǎng)［37］，而胰酶37℃時活性最好［38］。本實驗中利用預熱的含0.02%EDTA的0.5%胰酶消化3min后微載體上細胞基本能夠成功脫離，無粘連、結團現象。按照125 mL體系中優(yōu)化好的參數在1 L雙側壁培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細胞生長曲線良好。

由于Ⅱ型GCRV病毒接種細胞后不產生明顯CPE［39］，顯微鏡下無法觀察到CiSB細胞產生特征性的CPE，因此只能通過測定拷貝數的變化觀察Ⅱ型GCRV的增殖動態(tài)。病毒增殖后檢測結果表明，利用微載體培養(yǎng)，病毒感染第2天進入對數生長期，第5天達到峰值，較貼壁細胞瓶中拷貝數升高3倍，表明該工藝適合于Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的擴增。

本研究通過對CiSB細胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝中的各項參數進行優(yōu)化并進行1 L放大培養(yǎng)，初步建立了基因Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的微載體規(guī)模化培養(yǎng)工藝，細胞最大濃度可達1.98×106個·mL-1，接種GCRVⅡ型拷貝數最大達6.2×105拷貝數·μL-1。研究結果可以為草魚出血病流行基因型疫苗的規(guī)?；苽涞於ㄇ捌诨A。