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      m6A甲基化修飾在類風濕關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用*

      2022-11-15 12:22:29萬磊劉健黃傳兵趙磊孫廣瀚朱子衡李舒馬熙檬程靜胡賽賽李方澤陳瑩瑩
      中醫(yī)藥臨床雜志 2022年2期
      關鍵詞:甲基化酶基轉移酶類風濕

      萬磊,劉健,黃傳兵,趙磊,孫廣瀚,朱子衡,李舒,馬熙檬,程靜,胡賽賽,李方澤,陳瑩瑩

      1 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

      2 美國希望之城國家醫(yī)學中心和貝克曼研究所癌癥生物學系 美國加州 91010

      類風濕關節(jié)炎的主要臨床特征包括關節(jié)腫脹﹑發(fā)熱﹑疼痛﹑功能障礙和變形,這些都會導致關節(jié)殘疾和生活質量下降[1-2]。盡管我們對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制的認識有了很大的提高,但對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制的認識仍受疾病異質性的限制,靶向治療仍不理想。表觀遺傳學的作用,特別是 RNA 修飾在關節(jié)炎中的作用引起極大的關注[3]。已經(jīng)證明DNA和組蛋白的表觀遺傳修飾參與了類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制,但探討是否涉及RNA中N6-甲基腺苷(m6A)的修飾研究較少[4]。參與m6A調節(jié)的酶主要包括m6A甲基轉移酶(methyltransferase)﹑去甲基化酶(demethylase)﹑m6A結合蛋白(m6A-binding proteins)。它們對細胞生命的調控至關重要。對M6A甲基化機制的廣泛研究表明[5],與m6A相關的RNA水平的調控是復雜多樣的。研究表明[6-7],m6A修飾對于包括免疫應答在內的多種生物過程是必需的。并且有越來越多的證據(jù)表明,其失調與許多人類疾病有關。進一步研究m6A甲基化在類風濕關節(jié)炎中的作用機制,將對免疫性疾病的治療產(chǎn)生深遠的影響。

      m6A甲基化修飾基因

      1 甲基轉移酶

      m6A甲基化修飾在天然免疫應答和抗腫瘤免疫中起著不可或缺的作用。m6A甲基轉移酶促進m6A對RNA的甲基化修飾。最早發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉移酶是METTL3﹑METTL14和Wilms腫瘤1相關蛋白(WTAP)[8]。這些蛋白并不是各自孤立的,而是會形成復合物共同行使催化功能。METTL3是一種腫瘤抑制因子,因為它對m6A修飾具有上調作用。METTL3在一些腫瘤疾病中表達增加,并介導增殖﹑轉移和癌細胞的集落形成[9]。METTL3在類風濕關節(jié)炎中的作用機制尚不清楚。在類風濕關節(jié)炎患者中METTL3的表達顯著升高,METTL3通過NF-kB途徑影響類風濕關節(jié)炎炎癥因子的分泌[10]。因此,METTL3可能具有治療免疫疾病的潛力。研究表明[11],METTL14的缺失依賴于mTOR信號誘導的自噬。METTL3和METTL14這兩種蛋白有關鍵的催化結構域,兩者之間會形成雜絡物。其中METTL3是具有催化活性的亞基,而METTL14會在底物識別上起到關鍵作用。WTAP是一種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉移酶復合物。WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。WTAP表達降低時METTL3的RNA結合能力顯著減弱。這表明WTAP調節(jié)m6A甲基轉移酶復合物向mRNA靶的募集并影響其結合能力[12]。WTAP的功能沒有甲基化活性,但它與METTL3和METTL14復合物相互作用,顯著影響功能細胞m6A的沉積[13]。

      2 去甲基化酶

      m6A去甲基化酶是從RNA中去除m6A甲基化基團。最常見的去甲基化酶是肥胖相關蛋白(FTO)和烷基化修復同源蛋白5(ALKBH5)。

      FTO被認為是一種調節(jié)肥胖的蛋白。 屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關。FTO的過度激活會增加食物攝入,從而導致肥胖。無論是在DNA還是RNA中,F(xiàn)TO蛋白都是一種十分重要的去甲基化酶。FTO去除m6A修飾并調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性,這最終導致各種類型的疾病發(fā)生。FTO對疾病免疫逃逸至關重要。FTO蛋白在核心結構域上與Alkb蛋白家族相似,但是C端獨有的長loop與Alkb家族其他蛋白有所不同。正是這種特有的結構域使得FTO蛋白能夠對發(fā)生甲基化的單鏈DNA或單鏈RNA進行去甲基化修飾。一旦FTO基因轉錄水平發(fā)生異常,會引起多種風濕免疫性疾病如類風濕關節(jié)炎等[14]。ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶,能夠對細胞核中的mRNA進行去甲基化修飾,在N端有丙氨酸富集區(qū)和獨有的卷曲螺旋結構。在細胞系中敲低ALKBH5后,mRNA上m6A修飾水平顯著上升。ALKBH5缺失通過YTHDF2依賴的方式降低單核-巨噬細胞上炎癥因子的表達[15]。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5通過調節(jié)細胞遷移﹑侵襲和轉移來抑制細胞增殖。如果通過FTO和ALKBH5減少滑膜細胞的增殖和遷移,則可以延遲類風濕關節(jié)炎炎癥反應的發(fā)生。因此,m6A去甲基化酶FTO和ALKBN5有可能成為在類風濕關節(jié)炎治療的靶點。

      3 閱讀蛋白

      m6A修飾的mRNA行使特定的生物學功能需要一種特定的RNA結合蛋白,RNA結合蛋白通過與RNA中的m6A甲基化位點結合而發(fā)揮特定作用,其編碼基因被稱為閱讀蛋白。閱讀蛋白包括YTH結構域的蛋白﹑核不均一核糖蛋白以及真核起始因子(eIF)等。具有YTH結構域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等[16]。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結合m6A甲基化區(qū)域,削弱與RNA結合蛋白同源結合以及改變RNA二級結構從而改變蛋白與RNA的互作。YTHDF1-3主要在胞漿中特異性識別m6A修飾的mRNA[17]。YTHDF1通過與起始因子相互作用增強mRNA翻譯和蛋白質合成。YTHDF2通過選擇性結合并募集m6A-修飾的mRNA至mRNA衰變位點。YTHDF3已被認為是第一個閱讀蛋白。YTHDF3通過與其他因子相互作用增強RNA翻譯[18]。YTHDC1-2的作用部位主要在細胞核內。eIF3蛋白能夠與RNA 5’端UTR上發(fā)生m6A修飾的堿基相結合,從而促進mRNA的翻譯[19]。

      m6A甲基化修飾對類風濕關節(jié)炎的影響

      類風濕關節(jié)炎 特征在于免疫細胞浸潤﹑成纖維細胞樣滑膜細胞過度增殖以及軟骨和骨骼破壞。類風濕關節(jié)炎關鍵的病理變化是巨噬細胞樣滑膜細胞產(chǎn)生促炎細胞因子,包括 IL-1﹑IL-6 和 TNF[20]。大量研究表明調節(jié)免疫細胞是治療 類風濕關節(jié)炎 的關鍵靶點之一。m6A甲基化通過控制基因表達在各種生物過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化修飾參與對類風濕關節(jié)炎疾病的過程。m6A甲基轉移酶MetTL3通過調節(jié)細胞因子變化減輕類風濕關節(jié)炎炎癥反應[21]。

      研究發(fā)現(xiàn)[22],在類風濕關節(jié)炎患者中,外周血中MetTL3的表達顯著增加,但其他RNA m6A甲基轉移酶沒有明顯的變化。通過LPS刺激可以上調巨噬細胞中的MetTL3來增加總m6A含量,并且MetTL3相關的m6A修飾與細胞因子IL-6和TNF-a相關。研究表明,在類風濕關節(jié)炎患者m6A調節(jié)的甲基轉移酶﹑去甲基酶和閱讀蛋白表達發(fā)生變化[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)[24], m6A甲基轉移酶MetTL3通過激活NF-kB信號通路促進類風濕關節(jié)炎 FLs的炎癥反應。

      DNA異常甲基化可能參與了類風濕關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展,異常甲基化的基因可能成為類風濕關節(jié)炎評估發(fā)病﹑疾病進展和疾病嚴重程度的生物標記物或預測因子,也有望成為類風濕關節(jié)炎治療的潛在靶點[25]。 研究發(fā)現(xiàn)[26],METTL3 表達在人類風濕關節(jié)炎滑膜組織和大鼠 AIA 模型中顯著上調。METTL3敲低抑制了人 類風濕關節(jié)炎-FLS 和大鼠 AIA-FLS中的白介素 (IL)-6﹑基質金屬蛋白酶 (MMP)-3 和MMP-9 水平。相反,它們因 METTL3 過表達而增加。此外,在 FLS 中,METTL3 可能激活核因子 (NF)-κB信號通路。研究表明,METTL3可能通過NF-κB信號通路促進FLS激活和炎癥反應。

      通過c-Myc基因啟動子甲基化在類風濕關節(jié)炎發(fā)病中的作用研究發(fā)現(xiàn)[27],c-Myc基因低甲基化可能與類風濕關節(jié)炎的發(fā)病相關,且c-Myc(chr8:127736502)甲基化率與IL-17水平呈負相關。

      類風濕關節(jié)炎患者中ALKBH5﹑FTO和YTHDF2表達顯著變化[28]。YTHDF2 降低顯著增加了 LPS 誘導 的 IL-6 ﹑TNF-α﹑IL-1 β 和 IL-12水 平 表 達。研究發(fā)現(xiàn)[29],與對照組相比,類風濕關節(jié)炎 患者中ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的 mRNA 表達顯著降低。在接受常規(guī)治療的類風濕關節(jié)炎患者中,ALKBH5的mRNA表達顯著增加。 FTO 的 mRNA 表達與疾病活動性評分 28 (DAS28)﹑補體 3 (C3)﹑免疫球蛋白G (IgG) 和淋巴細胞與單核細胞比率 (LMR) 相關。YTHDF2 的 mRNA 表達與 RBC﹑L%﹑N%﹑NLR 和LMR 相關。邏輯回歸分析顯示,外周血中 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的表達降低是 類風濕關節(jié)炎 的危險因素。此外,與對照組相比,類風濕關節(jié)炎 患者外周血整體 m6A 含量顯著增加,并且 m6A 含量增加與 FTO mRNA 表達降低呈負相關。研究說明了 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 在 類風濕關節(jié)炎 中的關鍵作用,這為認識類風濕關節(jié)炎 的發(fā)病機制提供了新的見解,同時也是一種新型的類風濕關節(jié)炎 生物標志物。

      類風濕關節(jié)炎DNA甲基化干預研究

      劉喜德等[30]運用real time PCR﹑反義寡核苷酸技術﹑細胞培養(yǎng)﹑轉染等方法進行體內及體外實驗,基于miRNA-146a對類風濕關節(jié)炎患者DNA甲基化調控作用研究中藥溫化蠲痹方治療活動期類風濕關節(jié)炎增效的分子機制。了解ras-MAPKs信號轉導通路是否介導了miRNA-146a對DNA甲基化調控作用,研究溫化蠲痹方對miRNA-146a調控DNA甲基化作用的影響,闡釋其治療類風濕關節(jié)炎增效的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)中藥溫化蠲痹方具有下調類風濕關節(jié)炎患者外周血PBMC 微小RNA-146a表達,上調DNA甲基化轉移酶表達,可能通過ras-MAPKs信號轉導通路影響微小RNA-146a調控類風濕關節(jié)炎患者DNA甲基化作用而達到治療類風濕關節(jié)炎目的。

      劉煥興等[31]通過觀察甲氨蝶呤片(MTX)治療類風濕關節(jié)炎對Th17細胞DNA甲基化的影響及其機制。結果顯示,治療后ESR﹑CRP及PLT水平顯著降低(P<0.05),Th17細胞比例及IL-17水平顯著降低(P<0.001),DNMT1基因mRNA表達水平顯著升高(P<0.001),ROR-γt基因mRNA表達水平顯著降低(P<0.001),ROR-γt基因甲基化比例顯著增加(P<0.05);Th17細胞比例與IL-17水平呈正相關,ROR-γt基因甲基化程度與IL-17水平呈負相關(P<0.05)。說明甲氨蝶呤可通過提高類風濕關節(jié)炎患者Th17細胞ROR-γt基因甲基化程度抑制體內IL-17分泌改善和延緩疾病進程,同時此過程有DNMT1酶參與。

      劉亞飛等[32]利用風寒濕刺激類風濕關節(jié)炎動物模型,觀察風寒濕因素刺激對關節(jié)炎的DNA甲基化水平影響。結果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,風寒濕病證結合模型組關節(jié)炎指數(shù)評分≥5分的比例顯著升高。大鼠踝關節(jié)直徑顯著增加。與類風濕關節(jié)炎模型組相比,風寒濕病證結合模型組單個核細胞 DNA甲基化水平顯著下降。單個核細胞組蛋白H3乙?;接兴撸珶o統(tǒng)計學意義。結論風寒濕因素可能通過下調單個核細胞DNA甲基化水平,從而影響類風濕關節(jié)炎嚴重程度。

      John等[33]人通過對 早期類風濕性關節(jié)炎DNA 甲基化水平的測定,觀察緩解疾病的抗風濕藥(DMARD) 是否與調節(jié)DNA 甲基化水平有關。結果顯示 DNA 甲基化與早期 類風濕關節(jié)炎 中改善疾病的抗風濕藥物治療反應有關。

      綜上所述,m6A甲基化修飾蛋白是否參與類風濕關節(jié)炎疾病的發(fā)生和發(fā)展全過程需進一步研究。m6A 甲基轉移酶可以甲基化非編碼 RNA。然而,關于非編碼 RNA 與 m6A 在類風濕關節(jié)炎疾病中相互作用的研究很少。此外,m6A在T細胞穩(wěn)態(tài)或其他免疫細胞分化中的作用研究偏少。同時,關于藥物對m6A甲基化修飾蛋白的干預研究尤為不足。因此,需要進一步的研究來確定 m6A 在類風濕關節(jié)炎中的潛在作用靶點和分子機制。

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