萬磊,劉健,黃傳兵,趙磊,孫廣瀚,朱子衡,李舒,馬熙檬,程靜,胡賽賽,李方澤,陳瑩瑩
1 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031
2 美國希望之城國家醫(yī)學中心和貝克曼研究所癌癥生物學系 美國加州 91010
類風濕關節(jié)炎的主要臨床特征包括關節(jié)腫脹﹑發(fā)熱﹑疼痛﹑功能障礙和變形,這些都會導致關節(jié)殘疾和生活質量下降[1-2]。盡管我們對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制的認識有了很大的提高,但對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制的認識仍受疾病異質性的限制,靶向治療仍不理想。表觀遺傳學的作用,特別是 RNA 修飾在關節(jié)炎中的作用引起極大的關注[3]。已經(jīng)證明DNA和組蛋白的表觀遺傳修飾參與了類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制,但探討是否涉及RNA中N6-甲基腺苷(m6A)的修飾研究較少[4]。參與m6A調節(jié)的酶主要包括m6A甲基轉移酶(methyltransferase)﹑去甲基化酶(demethylase)﹑m6A結合蛋白(m6A-binding proteins)。它們對細胞生命的調控至關重要。對M6A甲基化機制的廣泛研究表明[5],與m6A相關的RNA水平的調控是復雜多樣的。研究表明[6-7],m6A修飾對于包括免疫應答在內的多種生物過程是必需的。并且有越來越多的證據(jù)表明,其失調與許多人類疾病有關。進一步研究m6A甲基化在類風濕關節(jié)炎中的作用機制,將對免疫性疾病的治療產(chǎn)生深遠的影響。
m6A甲基化修飾在天然免疫應答和抗腫瘤免疫中起著不可或缺的作用。m6A甲基轉移酶促進m6A對RNA的甲基化修飾。最早發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉移酶是METTL3﹑METTL14和Wilms腫瘤1相關蛋白(WTAP)[8]。這些蛋白并不是各自孤立的,而是會形成復合物共同行使催化功能。METTL3是一種腫瘤抑制因子,因為它對m6A修飾具有上調作用。METTL3在一些腫瘤疾病中表達增加,并介導增殖﹑轉移和癌細胞的集落形成[9]。METTL3在類風濕關節(jié)炎中的作用機制尚不清楚。在類風濕關節(jié)炎患者中METTL3的表達顯著升高,METTL3通過NF-kB途徑影響類風濕關節(jié)炎炎癥因子的分泌[10]。因此,METTL3可能具有治療免疫疾病的潛力。研究表明[11],METTL14的缺失依賴于mTOR信號誘導的自噬。METTL3和METTL14這兩種蛋白有關鍵的催化結構域,兩者之間會形成雜絡物。其中METTL3是具有催化活性的亞基,而METTL14會在底物識別上起到關鍵作用。WTAP是一種在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉移酶復合物。WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。WTAP表達降低時METTL3的RNA結合能力顯著減弱。這表明WTAP調節(jié)m6A甲基轉移酶復合物向mRNA靶的募集并影響其結合能力[12]。WTAP的功能沒有甲基化活性,但它與METTL3和METTL14復合物相互作用,顯著影響功能細胞m6A的沉積[13]。
m6A去甲基化酶是從RNA中去除m6A甲基化基團。最常見的去甲基化酶是肥胖相關蛋白(FTO)和烷基化修復同源蛋白5(ALKBH5)。
FTO被認為是一種調節(jié)肥胖的蛋白。 屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關。FTO的過度激活會增加食物攝入,從而導致肥胖。無論是在DNA還是RNA中,F(xiàn)TO蛋白都是一種十分重要的去甲基化酶。FTO去除m6A修飾并調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性,這最終導致各種類型的疾病發(fā)生。FTO對疾病免疫逃逸至關重要。FTO蛋白在核心結構域上與Alkb蛋白家族相似,但是C端獨有的長loop與Alkb家族其他蛋白有所不同。正是這種特有的結構域使得FTO蛋白能夠對發(fā)生甲基化的單鏈DNA或單鏈RNA進行去甲基化修飾。一旦FTO基因轉錄水平發(fā)生異常,會引起多種風濕免疫性疾病如類風濕關節(jié)炎等[14]。ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶,能夠對細胞核中的mRNA進行去甲基化修飾,在N端有丙氨酸富集區(qū)和獨有的卷曲螺旋結構。在細胞系中敲低ALKBH5后,mRNA上m6A修飾水平顯著上升。ALKBH5缺失通過YTHDF2依賴的方式降低單核-巨噬細胞上炎癥因子的表達[15]。m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5通過調節(jié)細胞遷移﹑侵襲和轉移來抑制細胞增殖。如果通過FTO和ALKBH5減少滑膜細胞的增殖和遷移,則可以延遲類風濕關節(jié)炎炎癥反應的發(fā)生。因此,m6A去甲基化酶FTO和ALKBN5有可能成為在類風濕關節(jié)炎治療的靶點。
m6A修飾的mRNA行使特定的生物學功能需要一種特定的RNA結合蛋白,RNA結合蛋白通過與RNA中的m6A甲基化位點結合而發(fā)揮特定作用,其編碼基因被稱為閱讀蛋白。閱讀蛋白包括YTH結構域的蛋白﹑核不均一核糖蛋白以及真核起始因子(eIF)等。具有YTH結構域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等[16]。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結合m6A甲基化區(qū)域,削弱與RNA結合蛋白同源結合以及改變RNA二級結構從而改變蛋白與RNA的互作。YTHDF1-3主要在胞漿中特異性識別m6A修飾的mRNA[17]。YTHDF1通過與起始因子相互作用增強mRNA翻譯和蛋白質合成。YTHDF2通過選擇性結合并募集m6A-修飾的mRNA至mRNA衰變位點。YTHDF3已被認為是第一個閱讀蛋白。YTHDF3通過與其他因子相互作用增強RNA翻譯[18]。YTHDC1-2的作用部位主要在細胞核內。eIF3蛋白能夠與RNA 5’端UTR上發(fā)生m6A修飾的堿基相結合,從而促進mRNA的翻譯[19]。
類風濕關節(jié)炎 特征在于免疫細胞浸潤﹑成纖維細胞樣滑膜細胞過度增殖以及軟骨和骨骼破壞。類風濕關節(jié)炎關鍵的病理變化是巨噬細胞樣滑膜細胞產(chǎn)生促炎細胞因子,包括 IL-1﹑IL-6 和 TNF[20]。大量研究表明調節(jié)免疫細胞是治療 類風濕關節(jié)炎 的關鍵靶點之一。m6A甲基化通過控制基因表達在各種生物過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化修飾參與對類風濕關節(jié)炎疾病的過程。m6A甲基轉移酶MetTL3通過調節(jié)細胞因子變化減輕類風濕關節(jié)炎炎癥反應[21]。
研究發(fā)現(xiàn)[22],在類風濕關節(jié)炎患者中,外周血中MetTL3的表達顯著增加,但其他RNA m6A甲基轉移酶沒有明顯的變化。通過LPS刺激可以上調巨噬細胞中的MetTL3來增加總m6A含量,并且MetTL3相關的m6A修飾與細胞因子IL-6和TNF-a相關。研究表明,在類風濕關節(jié)炎患者m6A調節(jié)的甲基轉移酶﹑去甲基酶和閱讀蛋白表達發(fā)生變化[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)[24], m6A甲基轉移酶MetTL3通過激活NF-kB信號通路促進類風濕關節(jié)炎 FLs的炎癥反應。
DNA異常甲基化可能參與了類風濕關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展,異常甲基化的基因可能成為類風濕關節(jié)炎評估發(fā)病﹑疾病進展和疾病嚴重程度的生物標記物或預測因子,也有望成為類風濕關節(jié)炎治療的潛在靶點[25]。 研究發(fā)現(xiàn)[26],METTL3 表達在人類風濕關節(jié)炎滑膜組織和大鼠 AIA 模型中顯著上調。METTL3敲低抑制了人 類風濕關節(jié)炎-FLS 和大鼠 AIA-FLS中的白介素 (IL)-6﹑基質金屬蛋白酶 (MMP)-3 和MMP-9 水平。相反,它們因 METTL3 過表達而增加。此外,在 FLS 中,METTL3 可能激活核因子 (NF)-κB信號通路。研究表明,METTL3可能通過NF-κB信號通路促進FLS激活和炎癥反應。
通過c-Myc基因啟動子甲基化在類風濕關節(jié)炎發(fā)病中的作用研究發(fā)現(xiàn)[27],c-Myc基因低甲基化可能與類風濕關節(jié)炎的發(fā)病相關,且c-Myc(chr8:127736502)甲基化率與IL-17水平呈負相關。
類風濕關節(jié)炎患者中ALKBH5﹑FTO和YTHDF2表達顯著變化[28]。YTHDF2 降低顯著增加了 LPS 誘導 的 IL-6 ﹑TNF-α﹑IL-1 β 和 IL-12水 平 表 達。研究發(fā)現(xiàn)[29],與對照組相比,類風濕關節(jié)炎 患者中ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的 mRNA 表達顯著降低。在接受常規(guī)治療的類風濕關節(jié)炎患者中,ALKBH5的mRNA表達顯著增加。 FTO 的 mRNA 表達與疾病活動性評分 28 (DAS28)﹑補體 3 (C3)﹑免疫球蛋白G (IgG) 和淋巴細胞與單核細胞比率 (LMR) 相關。YTHDF2 的 mRNA 表達與 RBC﹑L%﹑N%﹑NLR 和LMR 相關。邏輯回歸分析顯示,外周血中 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 的表達降低是 類風濕關節(jié)炎 的危險因素。此外,與對照組相比,類風濕關節(jié)炎 患者外周血整體 m6A 含量顯著增加,并且 m6A 含量增加與 FTO mRNA 表達降低呈負相關。研究說明了 ALKBH5﹑FTO 和 YTHDF2 在 類風濕關節(jié)炎 中的關鍵作用,這為認識類風濕關節(jié)炎 的發(fā)病機制提供了新的見解,同時也是一種新型的類風濕關節(jié)炎 生物標志物。
劉喜德等[30]運用real time PCR﹑反義寡核苷酸技術﹑細胞培養(yǎng)﹑轉染等方法進行體內及體外實驗,基于miRNA-146a對類風濕關節(jié)炎患者DNA甲基化調控作用研究中藥溫化蠲痹方治療活動期類風濕關節(jié)炎增效的分子機制。了解ras-MAPKs信號轉導通路是否介導了miRNA-146a對DNA甲基化調控作用,研究溫化蠲痹方對miRNA-146a調控DNA甲基化作用的影響,闡釋其治療類風濕關節(jié)炎增效的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)中藥溫化蠲痹方具有下調類風濕關節(jié)炎患者外周血PBMC 微小RNA-146a表達,上調DNA甲基化轉移酶表達,可能通過ras-MAPKs信號轉導通路影響微小RNA-146a調控類風濕關節(jié)炎患者DNA甲基化作用而達到治療類風濕關節(jié)炎目的。
劉煥興等[31]通過觀察甲氨蝶呤片(MTX)治療類風濕關節(jié)炎對Th17細胞DNA甲基化的影響及其機制。結果顯示,治療后ESR﹑CRP及PLT水平顯著降低(P<0.05),Th17細胞比例及IL-17水平顯著降低(P<0.001),DNMT1基因mRNA表達水平顯著升高(P<0.001),ROR-γt基因mRNA表達水平顯著降低(P<0.001),ROR-γt基因甲基化比例顯著增加(P<0.05);Th17細胞比例與IL-17水平呈正相關,ROR-γt基因甲基化程度與IL-17水平呈負相關(P<0.05)。說明甲氨蝶呤可通過提高類風濕關節(jié)炎患者Th17細胞ROR-γt基因甲基化程度抑制體內IL-17分泌改善和延緩疾病進程,同時此過程有DNMT1酶參與。
劉亞飛等[32]利用風寒濕刺激類風濕關節(jié)炎動物模型,觀察風寒濕因素刺激對關節(jié)炎的DNA甲基化水平影響。結果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,風寒濕病證結合模型組關節(jié)炎指數(shù)評分≥5分的比例顯著升高。大鼠踝關節(jié)直徑顯著增加。與類風濕關節(jié)炎模型組相比,風寒濕病證結合模型組單個核細胞 DNA甲基化水平顯著下降。單個核細胞組蛋白H3乙?;接兴撸珶o統(tǒng)計學意義。結論風寒濕因素可能通過下調單個核細胞DNA甲基化水平,從而影響類風濕關節(jié)炎嚴重程度。
John等[33]人通過對 早期類風濕性關節(jié)炎DNA 甲基化水平的測定,觀察緩解疾病的抗風濕藥(DMARD) 是否與調節(jié)DNA 甲基化水平有關。結果顯示 DNA 甲基化與早期 類風濕關節(jié)炎 中改善疾病的抗風濕藥物治療反應有關。
綜上所述,m6A甲基化修飾蛋白是否參與類風濕關節(jié)炎疾病的發(fā)生和發(fā)展全過程需進一步研究。m6A 甲基轉移酶可以甲基化非編碼 RNA。然而,關于非編碼 RNA 與 m6A 在類風濕關節(jié)炎疾病中相互作用的研究很少。此外,m6A在T細胞穩(wěn)態(tài)或其他免疫細胞分化中的作用研究偏少。同時,關于藥物對m6A甲基化修飾蛋白的干預研究尤為不足。因此,需要進一步的研究來確定 m6A 在類風濕關節(jié)炎中的潛在作用靶點和分子機制。