組胺通過Hippo-YAP信號(hào)通路影響鼻咽癌細(xì)胞增殖與侵襲的機(jī)制研究①

冼德生 曾銀萍 周小柳 李智群 王麗萍 羊俊維

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，?？?570102）

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一［1］。目前主要以放化療來幫助患者緩解臨床不適，但腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，因此深入揭示疾病的分子發(fā)展機(jī)制，尋找有效的抗腫瘤藥物對(duì)改善鼻咽癌患者的生命質(zhì)量具有重大意義［2-3］。組胺是一種由肥大細(xì)胞、血小板及T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的物質(zhì)。研究顯示，組胺參與細(xì)胞增殖、學(xué)習(xí)記憶、胃腸循環(huán)、炎癥應(yīng)激、變態(tài)反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理過程［4］。NICOUD等［5］研究報(bào)道，外源性補(bǔ)充組胺可明顯降低乳腺癌細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但有關(guān)組胺在鼻咽癌中的應(yīng)用報(bào)道較少。果蠅中的蛋白激酶Hippo-Yes協(xié)同蛋白（YAP）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)高度保守的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路主要通過大腫瘤抑制基因1（large tumor suppressor gene 1，LATS1）的甲基化及YAP的磷酸化發(fā)揮生物學(xué)效用。研究顯示，該通路參與調(diào)控肺癌、結(jié)腸癌、肝癌及食管癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲與惡性轉(zhuǎn)移、化療耐藥等生物學(xué)過程［6］。孫海力等［7］通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中鼻咽癌組織數(shù)據(jù)進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，Hippo-YAP信號(hào)在鼻咽癌組織中表達(dá)異常，參與鼻咽癌的病情進(jìn)展。本研究通過對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1的研究，從Hippo-YAP信號(hào)入手，觀察外源性組胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為臨床鼻咽癌的治療提供新的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)雄性SD大鼠裸鼠，6～8周齡，體質(zhì)量130～180 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0006。

1.1.3 主要試劑組胺（＞97%，5 g/瓶，美國Sigma公司）；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國Jackson公司）；CCK-8試劑盒、Western blot試劑盒（美國Invitrogen公司）；Transwell小室（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.1.4 主要儀器蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；BD-56集成式恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）；IXplore Standard倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及分組處理將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定條件：37℃、5%CO2，取對(duì)數(shù)生長期的組胺進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組：正常組、組胺低、中、高劑量組；其中，正常組不添加任何藥物常規(guī)培養(yǎng)；組胺低、中、高劑量組依次添加100、200、400μmol/L的組胺［8］。

1.2.2 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)調(diào)整細(xì)胞濃度，以2×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板，分組處理同1.2.1，輕輕混勻后，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，室溫下添加DAPI（15μg/ml）500μl，避光染色，干燥后上鏡觀察。

1.2.3 CCK-8法檢測各組CNE1細(xì)胞增殖以1×105個(gè)/孔將CNE1細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞分組同1.2.1，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入20μl CCK-8溶液，室溫下孵育5 h，Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀檢測A450。細(xì)胞增殖率（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白組孔）/A實(shí)驗(yàn)孔×100%［9］。

1.2.4 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲在Transwell小室上室加入200μl預(yù)先稀釋的不含血清的Matrigel膠，無菌干燥箱中過夜。調(diào)整各組細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/孔接種于上室，下室中加入700μl含血清的常規(guī)培養(yǎng)基，每組設(shè)8個(gè)孔，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS輕柔洗滌1次，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，采用圖像處理軟件Image-Pro Plus6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 四氯四乙基苯并咪唑羰花青（JC-1）染色檢測各組細(xì)胞的線粒體膜電位調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，分組處理同1.2.1，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS沖洗3次，分別收集各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，300μl JC-1進(jìn)行染色，室溫避光孵育30 min，觀察各組細(xì)胞中紅色（JC-1單體）和綠色熒光（JC-1復(fù)合物）變化，以紅色熒光和綠色熒光的比值評(píng)價(jià)各組細(xì)胞線粒體膜電位變化［10］。

1.2.6 建立皮下移植瘤裸鼠模型調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分組處理同1.2.1，輕輕混勻后，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待生長密度達(dá)到1×106個(gè)/ml時(shí)消化細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液待用。按隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為正常組、組胺低、中、高劑量組，將上述各組細(xì)胞懸液接種于裸鼠左前腋皮下，構(gòu)建鼻咽癌皮下移植瘤裸鼠模型，標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水喂養(yǎng)裸鼠，在第5天后可觀察到原位腫瘤［11］，在接種14 d后處死裸鼠，剝離瘤組織，稱量瘤組織質(zhì)量。

1.2.7 特異性PCR檢測各組細(xì)胞中LATS1甲基化水平胰酶消化細(xì)胞，離心稀釋成細(xì)胞懸液，分組處理同上，以1×105個(gè)/孔接種至6孔板；置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，提取各組細(xì)胞總DNA，進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理純化，采用甲基化特異性PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析目的基因的甲基化水平。甲基化引物序列如下［12］：正向引物5'-CACACTGAACCCCCTCATCT-3'，反向引物5'-ATTTTGTTGCATCCCCTCAG-3'；非甲基化引物序列如下：正向引物5'-ACCAGCAAGGGCAATCATAC-3'，反向引物5'-CATGATCAGTAGCGGGAGGT-3'；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，單次循環(huán)；94℃變性30 s；甲基化/非甲基化：53℃/57℃；72℃退火45 s，60℃延伸60 s，采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。

1.2.8 Western blot檢測各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)胰酶消化細(xì)胞，離心稀釋成細(xì)胞懸液，分組處理同上，以1×105個(gè)/孔接種至6孔板；置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，加入蛋白裂解液，常規(guī)提取總蛋白，測定濃度，置于沸水中變性，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，清洗后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗（1∶500），孵育過夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色［13］。以GAPDH為內(nèi)參，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞形態(tài)的影響DAPI染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞染色后呈現(xiàn)出均勻淺藍(lán)色光，核質(zhì)界限清晰，核膜完整，核質(zhì)均勻，低、中、高劑量組細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡狀態(tài)改變，且隨著組胺濃度升高，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞核膜破裂數(shù)量及染色質(zhì)固縮程度明顯加劇，見圖1。

圖1 DAPI染色結(jié)果（×200）Fig.1 Result of DAPI staining（×200）

2.2 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，與正常組相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖率明顯下降（分別為P=0.001、P=0.000、P=0.000），且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖2。

圖2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of cell proliferation

2.3 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞的侵襲的影響Transwell小室侵襲結(jié)果顯示，與正常組相比，細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖3。

圖3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×200）Fig.3 Result of cell invasion（×200）

2.4 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞線粒體膜電位的影響JC-1染色結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅色熒光，細(xì)胞低、中、高劑量組紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)；與正常組相比，細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光比值明顯降低（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），線粒體膜電位隨之下降，且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖4。

圖4 JC-1染色結(jié)果（×200）Fig.4 Result of JC-1 staining（×200）

2.5 組胺對(duì)裸鼠皮下移植瘤成瘤的影響皮下移植瘤結(jié)果顯示，與正常組相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞皮下成瘤組織質(zhì)量明顯降低（分別為P=0.002、P=0.001、P=0.000），且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖5。

圖5 各組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量比較Fig.5 Comparison of weight of subcutaneously transplanted tumor in each group of nude mice

2.6 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中LATS1甲基化的影響特異性PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中LATS1基因的甲基化比例明顯降低（分別為P=0.001、P=0.001、P=0.001），且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖6。

圖6 各組LATS1基因的甲基化水平Fig.6 Methylation level of LATS1 gene in each group of cell

2.7 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1表達(dá)明顯減少（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），且具有明顯的劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），細(xì)胞中LATS1表達(dá)明顯增多（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），且具有明顯劑量依賴性（分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000），見圖7。

圖7 各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)Fig.7 Expressions of YAP1，p-YAP1 and LATS1 in each group of cell

3 討論

常見于我國華南地區(qū)及東南亞的鼻咽癌是一種惡性程度較高的頭頸部腫瘤。該病尚無根治性措施使患者免受疾病困擾，盡管現(xiàn)有的早期干預(yù)和輔助治療手段有了較為明顯的進(jìn)步，但處于該病晚期的患者預(yù)后仍不令人滿意，五年生存率較低［14］。腫瘤細(xì)胞的無限增殖及遠(yuǎn)處惡性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗、失去生命的主要原因。因此深入揭示疾病的分子機(jī)制，尋找或開發(fā)新的治療藥物，更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床上鼻咽癌的治療，提高患者的生命質(zhì)量，都具有重大意義。

由組胺酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）將組胺酸脫羧基而成的組胺是機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控元件［15］。研究顯示內(nèi)源性組胺的功能影響造血過程、胚胎發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞增殖與分化、免疫調(diào)節(jié)及各種炎癥性應(yīng)激等生理機(jī)能［16］。但近來組胺與惡性腫瘤的關(guān)系引起眾多研究者的重視。LEE等［17］研究報(bào)道內(nèi)源性的組胺水平能夠評(píng)估胃癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性實(shí)體腫瘤的病情進(jìn)展；GRAUERS等［18］研究報(bào)道外源性組胺可靶向抑制乳腺癌細(xì)胞中的PD-1/PD-L1位點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促使其凋亡，發(fā)揮良好的抗腫瘤效用。LIM等［19］研究表明外源性組胺不僅能夠增強(qiáng)化療藥物如甲氨蝶呤、吉西他濱對(duì)腎細(xì)胞癌組織的滲透作用，還可減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟、直腸等靶器官的轉(zhuǎn)移。MASSARI等［20］報(bào)道外源性組胺能促使Treg/Th17趨于平衡，明顯改善肝癌荷瘤小鼠的免疫功能，促進(jìn)IL-10等抗腫瘤因子的釋放。SHI等［21］研究證實(shí)在炎癥性相關(guān)結(jié)腸癌動(dòng)物模型中，補(bǔ)充外源性組胺能夠促使腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降，促使腫瘤細(xì)胞能量代謝失衡，抑制腫瘤組織生長。本研究結(jié)果顯示，與正常組鼻咽癌細(xì)胞相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖明顯減少，細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，線粒體膜電位明顯降低，腫瘤體內(nèi)生長能力明顯受限，這些結(jié)果均提示組胺具有良好的抗腫瘤作用，但其是否能夠改善鼻咽癌患者的免疫能力是下一步實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

深入了解藥物的作用靶點(diǎn)有助于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。Hippo-YAP信號(hào)是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的通路［22］。該通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心是激酶的級(jí)聯(lián)磷酸化。DEY等［23］研究顯示，在結(jié)腸癌、腎癌中，位于Hippo信號(hào)上游的LATS1基因發(fā)生甲基化可導(dǎo)致通路內(nèi)一系列激酶發(fā)生級(jí)聯(lián)磷酸化，最終導(dǎo)致下游YAP蛋白的磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖。TANG等［24］研究報(bào)道抑制Hippo通路中YAP蛋白的激活，能明顯抑制胃癌細(xì)胞的線粒體功能，阻斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化所需的能量代謝過程，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CHEN等［25］研究證實(shí)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的LATS1基因發(fā)生去甲基化能夠阻止YAP信號(hào)入核，下調(diào)腫瘤生長與侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，組胺低、中、高劑量組細(xì)胞LATS1基因甲基化比例及YAP1、p-YAP1表達(dá)均明顯下降，LATS1表達(dá)明顯升高。說明組胺對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

綜合上述，組胺能抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的體外增殖與侵襲能力，降低其線粒體膜電位，使腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長明顯受限，這可能是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。組胺如何通過改善鼻咽癌患者免疫功能發(fā)揮綜合抗瘤功效將是下一步的研究重點(diǎn)。