生物合成果膠酶的研究進(jìn)展

朱孝霖，徐珂盼，羅雯，王怡，趙希岳，蔡志強(qiáng)*

常州大學(xué)藥學(xué)院（常州 213164）

果膠是一種天然復(fù)雜的糖類聚合物，在化學(xué)中，果膠被定義為是由α-1, 4共價(jià)鍵連接半乳糖醛酸單元組成的一種陰離子多糖。植物組織中的果膠常與纖維素或半纖維素等其他成分共價(jià)結(jié)合組成植物細(xì)胞壁，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。果膠常被用于酸奶制品、面包餡料，作為膠凝劑用于果醬、果凍。果膠按形態(tài)可劃分為3種，即果膠、原果膠和果膠酸[2]。

果膠酶屬于水解酶的一種，用于分解果膠物質(zhì)，廣泛存在于高等植物和微生物中。在紡織、造紙、醫(yī)藥工業(yè)、廢水處理、動(dòng)物飼料生產(chǎn)及原生質(zhì)體融合等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]，特別地在果酒釀造中具有提高出汁率、加速澄清等重要作用，由于果膠酶進(jìn)口較多，不僅增加生產(chǎn)成本，也使我國(guó)果酒生產(chǎn)技術(shù)受到制約，因此，自主研發(fā)出具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的果膠酶是目前各個(gè)行業(yè)中亟待解決的問(wèn)題[4]。果膠酶分類方法較多，一般可以分為原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶[5]。Amin等[6]預(yù)計(jì)到2021年，果膠酶市場(chǎng)規(guī)?？蛇_(dá)3 550萬(wàn)美元，而現(xiàn)有研究大多以微生物為主，也正是由于微生物生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，生產(chǎn)酶周期短，而且具有產(chǎn)量高、效率高、酶活好等優(yōu)點(diǎn)，因此也是工業(yè)產(chǎn)酶的首選。

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，果膠酶的研究在工藝優(yōu)化、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面取得突破性進(jìn)展[6]，也在盡可能滿足我們對(duì)果膠酶日益增長(zhǎng)的需求量，因此，著重對(duì)產(chǎn)果膠酶菌株篩選、誘變、生物合成、固定化果膠酶內(nèi)容進(jìn)行綜述，對(duì)果膠酶廣闊前景進(jìn)行展望，為商業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用、拓展全新應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 微生物果膠酶的研究

1.1 產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

微生物是產(chǎn)果膠酶的重要來(lái)源，是否有高的果膠酶活，菌株的品質(zhì)好壞是直接原因，因此近年來(lái)研究者在生產(chǎn)果膠酶的菌種選育方面也花費(fèi)大量精力，其中從大自然篩選優(yōu)質(zhì)的野生菌株便是最常規(guī)的方法[7]。

Anju等[8]首次報(bào)道索諾芽孢桿菌生產(chǎn)果膠酶，從腐爛的水果和蔬菜中用碘液顯色方法從果膠瓊脂平板篩選出的7株果膠酶產(chǎn)生菌中，進(jìn)一步確定索諾芽孢桿菌為最高效的菌株MPTD1，經(jīng)液體深層發(fā)酵優(yōu)化后最大酶活為2.43 U/mL。Akinyemi等[9]從尼日利亞拉各斯瀉湖中的腐爛木屑中分離出巨大芽孢桿菌、巴達(dá)維亞芽孢桿菌和擬芽孢桿菌，經(jīng)深層發(fā)酵以果膠為底物，進(jìn)行產(chǎn)果膠酶能力篩選，研究表明與其他2株篩選菌相比，擬芽孢桿菌產(chǎn)果膠酶活力最高。Saifur等[10]從韓國(guó)發(fā)酵食品泡菜中分離出產(chǎn)強(qiáng)堿的堿性果膠酶PNs31的枯草芽孢桿菌CBS31，使用碘-碘化鉀溶液染色、NaCl脫色方法進(jìn)行篩選。羅群等[11]使用剛果紅染色、NaCl溶液脫色方法，篩選出透明圈/菌落直徑比值較大的高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉。姜立春等[12]從腐爛水果中分離到1株產(chǎn)果膠酶的黃曲霉，使用果膠作為唯一碳源，結(jié)合盧戈氏碘液染色、生理鹽水脫色方法進(jìn)行篩選。有研究通過(guò)溴酚藍(lán)法根據(jù)透明圈大小判定果膠酶活的大小，進(jìn)而篩選出高產(chǎn)果膠酶的菌株；通過(guò)添加一定量CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），依據(jù)水解圈的大小來(lái)篩選高產(chǎn)果膠酶的菌株[5,11]。

1.2 產(chǎn)果膠酶菌株的常規(guī)育種

除了從大自然中篩選野生菌株生產(chǎn)果膠酶，將原始菌株經(jīng)紫外誘變、化學(xué)誘變、脈沖等多種單一或者復(fù)合方法進(jìn)行改變，獲得正向突變菌株，也是提高果膠酶酶活最常見(jiàn)的策略[12-13]。

車鑫[14]以Aspergillus terreusgxy12-2為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變中的輻射將能量傳遞到生物體內(nèi)，使得生物體內(nèi)各種分子發(fā)生電離、激發(fā)產(chǎn)生大量化學(xué)性質(zhì)十分活躍的自由原子或自由基團(tuán)，結(jié)合亞硝基胍誘變中烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起突變，從而篩選到A.terreusZH2-4和A.terreusZH2-11兩個(gè)正向突變菌株，與原始出發(fā)菌株相比，其誘變菌獲得的酸性果膠酶酶活分別提高到原來(lái)的1.45倍和1.02倍。張佰清等[15]通過(guò)脈沖方法誘變黑曲霉，獲取了高產(chǎn)果膠酶的正向突變菌株L9，與原始菌株相比，其果膠酶活力提高到182.22%±0.18%，可達(dá)192.67 U/mL。杜國(guó)軍等[16]也是采用復(fù)合誘變方法，即亞硝酸-紫外對(duì)黑曲霉HY-D3處理，獲得突變株HY-LL3，經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化，果膠酶酶活高達(dá)到3 124 U/g，與原始菌株相比，提高2.59倍。Rohena等[17]以黑曲霉YQ-13為出發(fā)菌株，結(jié)合紫外與氯化鋰復(fù)合誘變反復(fù)處理，使用碘液染色方法進(jìn)行初篩，依據(jù)產(chǎn)酶能力進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得1株能夠穩(wěn)定遺傳的正向突變菌株，其果膠酶活力為67.6 U/mL，比出發(fā)菌株提高2.44倍，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，果膠酶活力提高至92.1 U/mL。何海燕等[18]利用微波照射方法處理棘孢曲霉D80菌株，獲得1株正突變菌株DW75，與出發(fā)菌株D80相比，酶活提高2.47倍。由此可見(jiàn)菌株的常規(guī)誘變育種是一種有效提高果膠酶活力的普遍手段。

1.3 產(chǎn)果膠酶菌株的基因工程

除了通過(guò)常規(guī)的誘變菌株獲取正突變菌株來(lái)提高果膠酶生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者還對(duì)果膠酶的分子生物學(xué)方面進(jìn)行探究，從編碼果膠酶的基因入手，進(jìn)行克隆、純化、高效表達(dá)等多種基因工程手段來(lái)進(jìn)一步提高果膠酶酶活。

Rajulapati等[19]克隆耐熱梭狀芽孢桿菌來(lái)源的果膠甲酯酶基因至pET-28a，以大腸桿菌BL21為表達(dá)菌株，并添加異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明它與菊花歐文菌來(lái)源的果膠甲酯酶有38%同源性，而且重組Ct PME以可溶性蛋白形式表達(dá)，在SDS-PAGE凝膠上顯示1條分子量約35.2 kDa的單條帶，并結(jié)合最先進(jìn)、最準(zhǔn)確的方法MALDI-TOF MS分析其分子量，結(jié)果與凝膠顯示一致。劉曉肖等[20]以全基因合成的類芽孢桿菌來(lái)源的堿性果膠裂解酶基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含預(yù)測(cè)的信號(hào)肽及不含預(yù)測(cè)信號(hào)肽的果膠酶基因，并在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)，自身預(yù)測(cè)信號(hào)肽PF的使用使得甲醇誘導(dǎo)144 h時(shí)酶活提高111.66%，又在PF信號(hào)肽基礎(chǔ)上對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造，使得酶活進(jìn)一步提高51.47%，達(dá)到89.65 U/mL。Zhang等[21]克隆黑曲霉ZJ5果膠甲酯酶基因pME-zj5a，并成功在畢赤酵母中進(jìn)行高效異源表達(dá)，且PMEZJ5A與CaCl2配合使用會(huì)提高菠蘿硬度。Zhong等[22]克隆篩選出的木質(zhì)擬桿菌果膠甲基酯酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，且PxPME與CaCl2復(fù)合使用會(huì)將菠蘿塊的硬度提高114%。何玉蘭等[23]從黑曲霉來(lái)源的果膠裂解酶基因（pelA、pelB、pelC、pelD、pelF）中成功篩選并克隆出2個(gè)高表達(dá)基因pelA和pelD，及相應(yīng)黑曲霉轉(zhuǎn)化菌株SH2-PelA和SH2-PelD，并對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶工藝研究，結(jié)果表明在搖瓶發(fā)酵條件下最高酶活力分別為11 069.2和8 822.6 U/mL，在液體深層發(fā)酵條件下最高酶活力分別為65 148.8和35 670.0 U/mL，分別比搖瓶發(fā)酵酶活提高5.9倍和4.0倍，研究表明重組菌株的工業(yè)化大量生產(chǎn)酸性果膠裂解酶潛力。Sharma等[24]以農(nóng)業(yè)廢棄物為底物，獲得堿性木聚糖酶活力415.22±18.50 IU/mL，堿性果膠酶活力為109.10±8.80 IU/mL，這也是首次提出在短發(fā)酵周期下，優(yōu)化液體發(fā)酵條件，在接種物中利用木聚糖和果膠的粗提同時(shí)提高兩種堿性酶活性的方法。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究院首次報(bào)道從草酸青霉SX6中鑒定具有獨(dú)立催化結(jié)構(gòu)域，新的28家族雙功能果膠酶，具有果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶活性，與大多數(shù)真菌果膠甲酯酶相比，S6A對(duì)70% DM柑橘果膠具有較高的比活力（271.1 U/mg）[25-27]。綜上所述，基因工程改造是提高微生物所產(chǎn)果膠酶活的有效方法。

2 果膠酶固定化研究

生物酶一般都具有高催化活性、強(qiáng)底物專一性和對(duì)環(huán)境無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，如果果膠酶直接加入到工廠生產(chǎn)中，就很難再回收利用，所以在一定程度上提高生產(chǎn)成本。因此有研究通過(guò)探究固定化酶技術(shù)以提高回收利用率[28]。酶的固定化技術(shù)是通過(guò)物理或化學(xué)方法將游離酶和相應(yīng)載體結(jié)合，從而增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，加強(qiáng)保存運(yùn)輸；同時(shí)又能將酶與底物分離，達(dá)到重復(fù)利用、降低成本的目的。常用的物理方法有吸附法、包埋法等；化學(xué)方法有共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法等。

Haneef等[29]為提高酶的催化性能，采用聚丙烯酰胺凝膠包埋的方法對(duì)果膠酶進(jìn)行固定化，結(jié)果表明該方法不僅提高果膠酶的熱穩(wěn)定性，而且也提高果膠酶在各行各業(yè)中重復(fù)利用的可能性，即使經(jīng)過(guò)7次反應(yīng)，果膠酶仍保持50%以上的初始活力。Saifur等[10]為提高分離菌株所產(chǎn)果膠酶應(yīng)用的穩(wěn)定性，將果膠酶

PNs31固定在海藻酸鈣珠中，且研究結(jié)果表明固定化酶在第2輪和第3輪的重復(fù)使用試驗(yàn)中分別保持約83%和65%的相對(duì)活性。趙巖等經(jīng)過(guò)掃描電鏡和紅外光譜驗(yàn)證果膠裂解酶PpPel10a被成功固定化，研究采用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法對(duì)重組PpPel10a進(jìn)行固定化，經(jīng)過(guò)優(yōu)化固定材料參數(shù)，確定殼聚糖濃度、戊二醛濃度及酶濃度分別為3%，4%和0.8 mg/g時(shí)，固定化酶的活性達(dá)到最高值，固定化率達(dá)87.3%，且結(jié)果表明固定化酶具有更寬的溫度和pH穩(wěn)定性范圍。Papadaki等[28]固定化果膠酶的制備是通過(guò)包埋交聯(lián)法并結(jié)合超聲波作用，其研究結(jié)果表明在超聲波條件下果膠酶活性提高92.28%。漆丹萍等[30]研究發(fā)現(xiàn)在HPD-750樹(shù)脂上固定果膠酶后，仍得到相較游離果膠酶更廣泛的pH適用范圍和更好的熱穩(wěn)定性，并且此固定化酶可以重復(fù)使用10次左右，提高酶的回收利用，降低生產(chǎn)成本。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

生物類型催化劑是最綠色環(huán)保型的工業(yè)催化劑，而果膠酶因其良好性能而極具吸引力。自然界中的極端微生物因其廣泛的應(yīng)用類別而非常適合工業(yè)應(yīng)用，農(nóng)用工業(yè)副產(chǎn)品是一個(gè)好的底物選擇[30]，固態(tài)發(fā)酵等發(fā)酵過(guò)程也是最可靠的。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)合果膠酶研究現(xiàn)狀，對(duì)生物合成果膠酶方面進(jìn)行深入探究，這無(wú)疑對(duì)工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域來(lái)說(shuō)是一個(gè)福音，因此仍需在以下幾點(diǎn)有所側(cè)重：

（1）如何通過(guò)有效的基因工程手段改造果膠酶的生產(chǎn)菌株。

（2）如何通過(guò)固定化技術(shù)高效結(jié)合果膠酶和載體，進(jìn)而提高其回收利用率，并根據(jù)載體材料的不同，拓展果膠酶的全新應(yīng)用領(lǐng)域。

（3）改進(jìn)發(fā)酵工藝，高效提升果膠酶酶活，降低生產(chǎn)成本。

因此，我們應(yīng)繼續(xù)深入研究果膠酶的一系列課題，為拓展其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。