PAK1 和PAK4 在不同毛色綿羊皮膚中的表達(dá)與定位

趙紅霞，王志鵬，王天元，賽務(wù)加甫，龐全海*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西中國(guó)輻射研究院，山西太原 030000；3.山西省柳林縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西柳林 033300；4.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

對(duì)哺乳動(dòng)物的毛色長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的毛色、眼睛顏色和膚色由體內(nèi)黑色素的數(shù)量、質(zhì)量和分布狀況決定[1]。PAK 家族包括PAK1和PAK4[2]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4 是CREB 的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3]，它作用于小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）的上游，MITF 是黑素生成的主要轉(zhuǎn)錄因子[4]，激活的PAK4 通過(guò)2 條不同的信號(hào)通路促進(jìn)黑素合成：CREB/MITF/酪氨酸酶和β-catenin/MITF 信號(hào)通路[5]。同時(shí)有研究表明PAK1和PAK4參與皮膚細(xì)胞黑素合成[6]。PAK1 調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MAPK、AKT、WNT1/β-catenin、ERα、BAD 和NF-κB 等增殖和生存通路[7]。PAK1 還參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，傳遞控制細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)、細(xì)胞形狀和粘附的各種信號(hào)通路[8]。PAK4 是一個(gè)信號(hào)整合子，調(diào)節(jié)許多基本的細(xì)胞過(guò)程[9]，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞存活、胚胎發(fā)育、免疫防御和致癌轉(zhuǎn)化[10]。國(guó)內(nèi)外已有對(duì)小鼠中PAK1和PAK4基因影響黑色素生成等方面調(diào)控的研究，但在綿羊中PAK1 和PAK4 的相關(guān)研究尚未發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以白色、棕色和黑色綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)qRT-PCR、Western Blotting、免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測(cè)不同毛色綿羊皮膚中PAK1 和PAK4 的表達(dá)與定位，為其他品種綿羊毛色的研究奠定基礎(chǔ)，增進(jìn)對(duì)綿羊毛色生成調(diào)控機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)取材 在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊場(chǎng)隨機(jī)選取健康性成熟的白色、棕色和黑色哈薩克綿羊各3 只，取背部皮膚組織各3 塊。其中2 塊放入液氮中用于提取總RNA 和蛋白，1 塊直接放入4%的甲醛固定液中固定，制作組織切片，用于免疫組織化學(xué)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol Reagent（Invitrogen 公司）；Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa 公司），PAK1 兔抗多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)公司）；PAK4 兔抗多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)公司）；Rabbit anti-β-actin 多克隆抗體、Goat Anti-Rabbit IgG（武漢三鷹生物技術(shù)公司）；組織蛋白提取試劑盒、凝膠制備試劑盒、DAB 試劑盒、BCA 蛋白濃度試劑盒、ECL Plus 超敏發(fā)光液（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 使用Trizol 試劑分離保存于液氮中的黑、棕、白色綿羊皮膚組織的總RNA，用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI 上檢索綿羊的PAK1和PAK4序列并使用Premier 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列及PCR 擴(kuò)增條件

1.3.3 qRT-PCR 檢測(cè) 根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）擴(kuò)增特異性DNA 序列，反應(yīng)體系25 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 12.5 μL，10 μmol/μL的 正、反向引物各0.8 μL，50 ng/μL 的cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL 和ddH2O（滅菌蒸餾水）6.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線、熔解曲線和CT 值，用2-ΔΔCT法計(jì)算定量結(jié)果。

1.3.4 Western Boltting 檢測(cè) 將存于液氮中的樣品組織研磨后，根據(jù)組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度。在10%SDS-PAGE 電泳分離后，200 mA 轉(zhuǎn)膜90 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，4℃過(guò)夜孵育一抗（1:1 000 稀釋PAK1 兔抗多克隆抗體；1:500 稀釋PAK4 兔抗多克隆抗體）。次日TBST 緩沖液洗膜，10 min×3，孵育二抗（1:5 000，HRP-山羊抗兔IgG），室溫?fù)u床1 h，TBST 緩沖液10 min×3，最后用膠片暗室曝光。使用Image-Pro Plus8.0 軟件檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)參灰度值，用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將置于4% 甲醛固定液固定24 h 的樣品組織取出，經(jīng)梯度酒精脫水后進(jìn)行包埋并制作切片。將切片置于檸檬酸鈉修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，然后滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 沖洗。滴加山羊血清工作液室溫孵育15 min，棄去血清，切片一側(cè)滴加1:100 稀釋的Rabbit Anti-PAK1 抗體（1:50 稀釋的Rabbit Anti-PAK4 抗體），陰性對(duì)照組滴加PBS，4℃過(guò)夜孵育。次日PBS 沖洗之后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育15 min，PBS 沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，PBS 沖洗；滴加DAB 顯色液，使用顯微鏡鏡下控制顯色時(shí)間，將染色控制在最佳狀態(tài)，PBS 沖洗；蘇木素復(fù)染40 s，蒸餾水沖洗，75%的鹽酸酒精分化1 min。最后脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1PAK1、PAK4在不同毛色綿羊皮膚組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量 qRT-PCR 結(jié)果顯示（圖1A），PAK1mRNA 在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量分別是棕色和白色的3.05 倍和7.29 倍（P＜0.01），棕色綿羊皮膚中的表達(dá)量是白色的2.39 倍（P＜0.01）。圖1BPAK4mRNA在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量分別是棕色和白色的3.47倍和7.7 倍（P＜0.01），棕色綿羊皮膚中的表達(dá)量是白色的2.22 倍（P＜0.05）。

圖1 PAK1 和PAK4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

2.2 PAK1、PAK4 蛋白在不同毛色綿羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量 Western Blotting 結(jié)果顯示（圖2A），在黑、棕和白色綿羊皮膚組織中均存在與PAK1、PAK4 多克隆抗體發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)的條帶，PAK1、PAK4 和GAPDH分別在分子量為64 kDa、65 kDa 和36 kDa 檢測(cè)到條帶。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)目的蛋白曝光出印跡的面積和灰度值計(jì)算出相關(guān)數(shù)據(jù)，將其同GAPDH 的條帶值相比較，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果可知，PAK1 蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量是棕色綿羊皮膚的1.26倍，是白色綿羊皮膚的1.34 倍；PAK4 蛋白在棕色和黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量分別是白色綿羊皮膚的1.81倍和2.2 倍，黑色綿羊皮膚的表達(dá)量是棕色綿羊皮膚的1.21 倍。

圖2 PAK1 和PAK4 蛋白在黑色、棕色和白色綿羊皮膚的蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.3 不同毛色綿羊皮膚組織中PAK1 蛋白和PAK4 蛋白的表達(dá)與定位 通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)PAK1 蛋白和PAK4 蛋白在綿羊皮膚組織中的表達(dá)進(jìn)行定位研究，結(jié)果顯示（圖3），PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干中有陽(yáng)性表達(dá)，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球中有陽(yáng)性表達(dá)，在棕色綿羊的表皮、根鞘中有陽(yáng)性表達(dá)，而相應(yīng)的陰性對(duì)照中無(wú)表達(dá)。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘、毛基質(zhì)中均有表達(dá)，而相應(yīng)的陰性對(duì)照中無(wú)表達(dá)（圖4）。

圖3 PAK1 蛋白在綿羊皮膚中的定位

圖4 PAK4 蛋白在綿羊皮膚中的定位

3 討 論

毛囊是哺乳動(dòng)物特有的皮膚附屬器官[11]，具有復(fù)雜的形態(tài)變化和生理發(fā)育過(guò)程[12]。毛囊數(shù)量龐大且位于體表，易于操作，是研究細(xì)胞增殖、分化、凋亡等科學(xué)問(wèn)題的良好模型[13]。研究發(fā)現(xiàn)，含羞草四肽（MFFY、MFWY 和MFYY）和組氨酸衍生物（H1-3）有抗黑素活性。這些化合物的抗黑色素生成活性很可能主要是由于它們的抗PAK1 作用[6]。許多草本PAK1 阻斷劑，如蜂膠和姜黃素，已被證明通過(guò)下調(diào)酪氨酸酶以及黑素合成/致癌轉(zhuǎn)錄因子（如β-catenin 和MITF）來(lái)抑制黑素合成[14]，β-catenin 是PAK1 和PAK4 等激酶的直接底物之一，這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)酪氨酸酶基因的激活是必不可少的[15]。

PAK1 通過(guò)在Ser 675 磷酸化直接激活β-catenin[16]，導(dǎo)致MITF 的激活，這對(duì)于編碼黑素生成酶如酪氨酸酶（Tyr）基因的表達(dá)是必需的。PAK4 也通過(guò)激活2 種轉(zhuǎn)錄因子CREB 和β-catenin 參與同一黑色素瘤細(xì)胞系的黑色素生成[17]，這2 種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)MIFT 激活都是必需的[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAK1 mRNA 和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量最高，棕色次之，白色最低。前人研究發(fā)現(xiàn)從人黑素細(xì)胞中分離出的富含黑素小體的組分表達(dá)PAK1 和N-WASP。PAK1 激酶活性的降低會(huì)影響黑素生成[19]。

PAK4 是生物學(xué)界最新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)蛋白因子[20]，它在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起非常重要的作用[21]。PAK1 負(fù)責(zé)誘導(dǎo)性黑素生成，而PAK4 主要負(fù)責(zé)基礎(chǔ)黑素生成[17]。PAK4 是CREB 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22]，在UV/α-MSH 誘導(dǎo)的黑素合成中，PAK4 上調(diào)了MITF 的轉(zhuǎn)錄[23]。PAK4 通過(guò)CREB 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)α-MSH/UVB誘導(dǎo)黑素合成，并提示PAK4 可能是治療色素沉著障礙的潛在靶點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAK4mRNA 和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量最高，棕色次之，白色最低，與前人研究結(jié)果一致[5]。推測(cè)PAK4 可能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素的生成進(jìn)而調(diào)控哈薩克綿羊毛色生成過(guò)程。

哺乳動(dòng)物的毛色主要取決于黑色素在皮膚和頭發(fā)中的類(lèi)型、數(shù)量和分布[24]，在對(duì)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)黑色素是在毛囊球莖中產(chǎn)生的[25]。在老鼠皮膚的毛發(fā)部分，分化的黑素細(xì)胞被限制在毛囊的球狀區(qū)域，在那里它們負(fù)責(zé)毛發(fā)的色素沉積。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干中有陽(yáng)性表達(dá)，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球中有陽(yáng)性表達(dá)，在棕色綿羊的表皮、根鞘中有陽(yáng)性表達(dá)。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘還有毛基質(zhì)中也有表達(dá)，表明PAK1 和PAK4 對(duì)毛囊發(fā)育及毛色形成具有一定作用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAK1和PAK4基因在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于白色綿羊皮膚；PAK1 和PAK4 蛋白在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于白色綿羊皮膚；PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干表達(dá)，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球表達(dá)，在棕色綿羊的表皮、根鞘表達(dá)，PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘、毛基質(zhì)中均有表達(dá)。綜上表明，PAK1 和PAK4 可能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素的生成進(jìn)而調(diào)控哈薩克綿羊毛色生成過(guò)程。