添加IGF-1 對(duì)體外培養(yǎng)不同直徑豬卵泡中卵母細(xì)胞成熟率的影響

劉子嶷，李凱揚(yáng)，王 鵬，李文韜，周祖陽(yáng)，孫小勇，劉玉芳*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056001；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，北京 100191）

豬作為常見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，具有高繁殖潛力和維護(hù)成本低的特點(diǎn)[1]。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)（IVM）作為產(chǎn)生豬胚胎的方式之一在生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中越來(lái)越重要[2-4]。IVM 通過判斷第一極體排出作為篩選成熟卵母細(xì)胞的主要標(biāo)志[5]。此外，卵母細(xì)胞的發(fā)育離不開卵丘細(xì)胞，卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟過程不斷提供營(yíng)養(yǎng)，并介導(dǎo)激素對(duì)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）產(chǎn)生影響[6-7]。卵丘擴(kuò)張?jiān)诼涯讣?xì)胞成熟過程中也起著重要作用，卵丘越擴(kuò)張說(shuō)明卵母細(xì)胞發(fā)育潛力越大[8]。卵母細(xì)胞成熟過程中胞核和胞質(zhì)的變化是顯示卵母細(xì)胞發(fā)育能力的關(guān)鍵，卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量也被用作細(xì)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)，較高的GSH 水平與原核形成呈正相關(guān)[9-10]。以往研究者進(jìn)行了大量試驗(yàn)來(lái)提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率，如在成熟培養(yǎng)液中添加不同成分以促進(jìn)其發(fā)育成熟[4,11-13]。

研究發(fā)現(xiàn)，胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）等多肽生長(zhǎng)因子參與卵巢的生理功能，發(fā)揮積極作用[14-15]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是一種結(jié)構(gòu)和功能上與胰島素密切相關(guān)的單鏈血清肽[16]，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、芳香化酶活性和孕酮生物合成[17]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 可由豬卵泡和顆粒細(xì)胞釋放，培養(yǎng)基中添加IGF-1 可刺激豬卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和體外成熟[18]。研究證明，在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度IGF-1（10～80 ng/mL）均可以促進(jìn)細(xì)胞核成熟[19]。另有研究報(bào)道，較大直徑卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞體外成熟率較高，且能提供較好的體外胚胎[20]。為深入了解IGF-1 對(duì)豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟率的影響，本研究評(píng)估了IGF-1對(duì)豬不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞IVM 的影響，并檢測(cè)了卵母細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）含量，以期探究添加外源IGF-1 對(duì)3 種直徑卵泡卵母細(xì)胞成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及培養(yǎng)液的配置

1.1.1 主要試劑 氯化鈉（NaCl）、牛血清白蛋白（BSA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、葡萄糖（D-Glucose）、聚乙烯醇（PVA）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、丙酮酸鈉（Na-Pyruvate）青霉素、鏈霉素均購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)），表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、IGF-1 均購(gòu)自Novoprotein 公司（上海），透明質(zhì)酸酶、石蠟油、多聚甲醛均購(gòu)自Solarbio公司（北京），Medium 199 購(gòu)自Gibco 公司（美國(guó)），Hochest 33342 購(gòu)自Invitrogen 公司（美國(guó)）。

1.1.2 培養(yǎng)液的配置 洗卵液：3.3315 g NaCl+1.5 g BSA+1.1915 g Hepes+0.084 g NaHCO3，徹底溶解于滅菌純化水。

成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液：0.015 g NaHCO3+0.0275 gDGlucose+0.005 g Na-Pyruvate+0.05 g PVA+0.033 g 青霉素+0.025g 鏈霉素，徹底溶解于50 mL Medium199。

成熟培養(yǎng)工作液：基礎(chǔ)液+4.4 μL FSH+4.4 μL LH+4 μL EGF+400 μL 豬卵泡液。

將配好的成熟培養(yǎng)工作液過濾后加入到四孔板中，每孔700 μL，覆蓋石蠟油。置于39℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱平衡2 h。100 μL 成熟培養(yǎng)工作液制作洗滴并用石蠟油覆蓋，放培養(yǎng)箱平衡2 h。每個(gè)滴20～30個(gè)COCs，每個(gè)孔50 個(gè)COCs。

1.2 卵巢采集及處理 于屠宰場(chǎng)收集豬卵巢置于保溫桶中，浸泡于30～38℃含雙抗（青、鏈霉素）的滅菌生理鹽水中，4 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用加入雙抗的37℃生理鹽水沖洗卵巢3～5 次，剪去卵巢上多余的結(jié)締組織。

1.3 卵母細(xì)胞收集 按照卵泡直徑分別收集2～3、3～5 mm和5～8 mm 3 組COCs，用注射器分別抽取卵泡液置于滅菌離心管中，37℃靜置15 min 至細(xì)胞沉淀，用抽卵針在顯微鏡下按照分組分別挑出胞質(zhì)完整均勻且卵丘在3～5 層的COCs，用洗卵液洗3 遍。

1.4 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng) 挑選符合要求的COCs 在預(yù)熱的洗滴中洗3 遍，最后轉(zhuǎn)入四孔板中。在39℃，5%CO2，飽和濕度下體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟，48 h 后統(tǒng)計(jì)卵丘擴(kuò)散率。再將細(xì)胞移至0.2%透明質(zhì)酸酶中脫去卵丘細(xì)胞，裸卵用4%多聚甲醛固定1 h 后PBS 洗3 遍，用Hochest 33342 避光染色5 min，再用PBS 洗3 次后，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)第一極體的排出率。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 IGF-1 對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響 在成熟培養(yǎng)工作液的基礎(chǔ)上+30 ng/mL IGF-1 進(jìn)行體外培養(yǎng)，設(shè)置對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)其卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率，判定添加IGF-1 能否影響豬卵母細(xì)胞成熟率。

1.5.2 IGF-1 對(duì)不同直徑卵母細(xì)胞成熟的影響 根據(jù)不同直徑卵泡（2～3、3～5 mm 和5～8 mm）進(jìn)行分組，分別添加IGF-1 的成熟培養(yǎng)工作液進(jìn)行體外培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率，判定IGF-1 是否影響不同直徑卵泡卵母細(xì)胞的成熟。

1.6 卵母細(xì)胞中GSH 的檢測(cè) 在成熟培養(yǎng)的44 h 取COCs，用0.2% 透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，采用碧云天試劑盒S0052（碧云天生物技術(shù)有限公司，北京）對(duì)卵母細(xì)胞中GSH 的含量進(jìn)行檢測(cè)。每組30 枚卵母細(xì)胞移入新鮮配制的10 μL 蛋白去除試劑M 中，在液氮和37℃水浴鍋中反復(fù)凍融3 次，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品與樣品吸光值的檢測(cè)。采用動(dòng)力學(xué)測(cè)定法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取某一濃度GSH 的標(biāo)準(zhǔn)樣品與GSH 檢測(cè)工作液混合，測(cè)定405 nm 處樣品吸光值。以不同GSH 標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)x，以與其對(duì)應(yīng)濃度下OD412 吸光值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)曲線方程計(jì)算卵母細(xì)胞中GSH 含量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，顯示的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.7 卵母細(xì)胞中ROS 的檢測(cè) 在成熟培養(yǎng)的44 h 后取COCs，用0.2%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，根據(jù)碧云天S0033 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，北京）說(shuō)明，按照1:1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 mol/L。將卵母細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔5 min 顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用ROS 陽(yáng)性對(duì)照刺激細(xì)胞30 min。使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)，檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱，用Image J 進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，顯示的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，使用LSD 法和Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＞0.05 為差異不顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 經(jīng)過44 h 體外成熟培養(yǎng)，大部分COCs 擴(kuò)展面積明顯增大（圖1）。在IVM 前形態(tài)較好的卵母細(xì)胞，其周圍卵丘細(xì)胞排列緊密，整個(gè)卵母細(xì)胞被卵丘細(xì)胞完全包裹。IVM 過程中COCs 逐步伸展，卵丘細(xì)胞之間的間隙變大，卵母細(xì)胞中央生發(fā)泡發(fā)生破裂，IVM 后44 h COCs 變得更加舒展，用0.2%透明質(zhì)酸酶處理后得到卵母細(xì)胞，用顯微鏡觀察到卵母細(xì)胞卵周間隙中第一極體（PbI）的排出（圖2）。

圖1 3～5 層卵丘的COC（左）與培養(yǎng)44 h 卵丘擴(kuò)展的COC（右）

圖2 卵母細(xì)胞第一極體排出

2.2 IGF-1 對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 COC 體外成熟培養(yǎng)44 h 后，觀察到卵丘層大部分?jǐn)U展且面積變?yōu)槌跏? 倍左右大小，可說(shuō)明該COC 整體擴(kuò)展效果較好[21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加IGF-1 組COC 擴(kuò)展數(shù)為356 個(gè)，擴(kuò)展率為92.0%；對(duì)照組有295 個(gè)擴(kuò)展，擴(kuò)展率為87.5%，添加組的擴(kuò)展率高于對(duì)照組（P＜0.05）。從第一極體排出情況來(lái)看，添加組排出數(shù)為152，對(duì)照組排出數(shù)為108，添加IGF-1 和對(duì)照組的第一極體排出率分別為39.3%和32.0%（P＜0.05）（表1）。

表1 添加IGF-1 進(jìn)行卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的卵丘擴(kuò)展數(shù)和第一極體排出數(shù)

2.3 IGF-1 對(duì)豬不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞成熟的影響添加IGF-1 成熟培養(yǎng)組中卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率為3～5 mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＞0.05），第一極體排出率為3～5mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＜0.05）（表2）。

表2 豬不同直徑卵泡卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中添加IGF-1卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率

將337 個(gè)未添加外源IGF-1 的COC 也分別按照3種卵泡直徑進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，設(shè)置為對(duì)照組，結(jié)果如表3 所示，5～8 mm 組卵丘擴(kuò)展率最高（89.9%），其次是3～5 mm 組（89.3%），2～3 mm 組最低（82.1%）且與上述2 組間差異顯著，但3～5 mm 和5～8 mm 差異不顯著。5～8 mm 組第一極體排出率最高（40.8%），其次是3～5 mm 組（34.5%），最低是2～3 mm 組（18.9%），3 組間差異顯著。添加組3～5 mm 的卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率為最高。

表3 豬不同直徑卵泡卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中未添加IGF-1卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率

2.4 GSH 含量檢測(cè) 按照總谷胱甘肽試劑盒說(shuō)明書操作，先用GSH 標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），以總谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)x，405 nm 吸光值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程y=0.1354x+0.1195，其中R2=0.998 7～0.990 0，吻合程度較高。

圖3 GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如表4 所示，與對(duì)照組相比，添加IGF-1 組GSH含量較高（P＜0.05）。由表5 可知，添加IGF-1 組中各直徑卵母細(xì)胞GSH 含量為5～8 mm 組與3～5 mm 組顯著高于2～3 mm 組，前2 組間無(wú)顯著差異。

表4 添加IGF-1 和對(duì)照組卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h 測(cè)定GSH 含量

表5 豬不同直徑卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加IGF-1 的GSH 含量

由表6 可知，未添加IGF-1 組中，3 種直徑卵泡來(lái)源卵母細(xì)胞在培養(yǎng)44 h 后GSH 含量差異不顯著。

表6 豬不同直徑卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液未添加IGF-1 的GSH 含量

2.5 卵母細(xì)胞ROS 的檢測(cè) 如表7 所示，在添加IGF-1組中，5～8 mm 卵泡卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，其ROS 平均熒光強(qiáng)度為0.201，而2～3 mm 的熒光強(qiáng)度最高為0.376。3～5 mm 和5～8 mm 組間差異不顯著，但與2～3 mm 組差異顯著。如表8 所示，3 種直徑卵泡來(lái)源卵母細(xì)胞在培養(yǎng)44 h 后ROS 熒光強(qiáng)度差異不顯著。

表7 豬不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加IGF-1 的ROS 熒光強(qiáng)度

表8 豬不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液未添加IGF-1 的ROS 熒光強(qiáng)度

3 討 論

生長(zhǎng)因子在卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育過程中起重要作用，它們可能是促進(jìn)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞成熟的決定性因素[22]。IGF-1 在體內(nèi)協(xié)同促性腺激素，類固醇激素和其他的分子調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育，同時(shí)IGF-1 也能促進(jìn)卵母細(xì)胞體外核成熟，這一結(jié)果有助于詮釋調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞體外成熟的因子的作用機(jī)制[23]。Sato 等[24]證實(shí)了添加IGF-1對(duì)犬卵母細(xì)胞成熟率和卵丘擴(kuò)張有積極的影響，但是需要較高水平的IGF-1（50 μg/mL）。在牛卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，IGF-1（100 ng/mL）已被證明能刺激牛卵母細(xì)胞的卵丘擴(kuò)張和核成熟[25]。卵丘擴(kuò)張是反映卵母細(xì)胞成熟以及隨后的發(fā)育能力的一個(gè)指標(biāo)[26]。本研究通過對(duì)第一極體排出、GSH 含量測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)添加IGF-1 后對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟率顯著優(yōu)于未添加組，表明添加IGF-1 可以促進(jìn)豬卵母細(xì)胞體外成熟。

在哺乳動(dòng)物的研究中，卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞成熟、排卵及人工授精具有重要意義[27]。目前，用于體外胚胎研究的卵母細(xì)胞通常取自直徑3～6 mm 卵泡，但卵巢中存在大量直徑小于3 mm 的卵泡[28]。為獲得小于3 mm 卵泡卵母細(xì)胞體外成熟情況，Yoon 等[29]研究發(fā)現(xiàn)直徑小于3 mm 的豬卵泡卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力明顯弱于直徑大于3 mm 的卵泡。本研究統(tǒng)計(jì)了添加IGF-1 體外成熟44 h 后不同直徑的成熟率，發(fā)現(xiàn)直徑為3～5 mm的COCs 卵丘擴(kuò)展率顯著比2～3 mm 和5～8 mm 高，第一極體排出率最高為3～5 mm（46.9%），證明添加外源IGF-1 后3～5 mm 卵泡卵母細(xì)胞成熟率較高。

卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中活性氧的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致DNA損傷和線粒體功能障礙，影響卵母細(xì)胞的發(fā)育[30-31]。而在IVM 過程中，ROS 產(chǎn)生量比體內(nèi)成熟的產(chǎn)生量多，過多的ROS 會(huì)使卵母細(xì)胞退化，影響成熟效率，而GSH 可保護(hù)細(xì)胞免受ROS 損害[32]。GSH 在卵母細(xì)胞體外成熟過程中協(xié)助卵母細(xì)胞抵抗氧壓力，參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，為蛋白合成提供原料，保障DNA 和蛋白合成所需的能量、協(xié)助微管合成，影響紡錘體的形態(tài)，在卵母細(xì)胞中起到重要作用[33]。因此，卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 含量也是衡量卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[34]。本研究中添加組5～8mm 卵泡COCs 中GSH 含量最高，但僅與2～3 mm 組差異顯著，而未添加組的3 種直徑間差異不顯著。檢測(cè)ROS 結(jié)果可知，添加組5～8 mm 平均熒光強(qiáng)度最低，而2～3 mm 的熒光強(qiáng)度最高，5～8 mm 與2～3 mm 組差異顯著，但與3～5 mm 差異不顯著。未添加組中三種直徑間ROS 差異不顯著。

4 小 結(jié)

綜上所述，經(jīng)過對(duì)豬不同直徑卵泡中COCs 44 h 體外成熟培養(yǎng)，比較卵丘擴(kuò)展、第一極體、GSH 和ROS含量來(lái)看，添加IGF-1 使3～5 mm 卵泡卵丘擴(kuò)展率和第一極體排出率增高。同時(shí)添加組3～5 mm 和5～8 mm 中GSH 顯著降低了卵母細(xì)胞ROS 水平，改善卵母細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。