響應(yīng)面法優(yōu)化無(wú)核白葡萄果醋發(fā)酵工藝

嚴(yán)玉玲，郭 焰，豆一玲，黃文書(shū)

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052）

無(wú)核白葡萄果呈橢圓形，果糖含量多，是葡萄中的“綠色明珠”[1]。該品種含糖量可達(dá)20%～30%，含酸量種類多，富含多種蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)素。時(shí)常食用能有效抗氧化、耐衰老、預(yù)防癌癥、調(diào)節(jié)心血管及內(nèi)分泌系統(tǒng)。近年來(lái)，葡萄醋飲料受到老百姓的喜愛(ài)，是在現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)上加工而成的，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗為豐厚?？谖渡屑?，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2-3]。無(wú)核白葡萄營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高但其加工水平較低，基本處于初級(jí)加工階段[4]。

液態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高、易于操控的優(yōu)點(diǎn)，但仍有不足之處，最明顯的缺點(diǎn)是菌種單一、酸味濃厚。保證在不改變酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)的基礎(chǔ)上，盡量食用混合菌種來(lái)發(fā)酵，能為發(fā)酵階段提供豐富的風(fēng)味物質(zhì)[5-6]。利用新疆富足的葡萄資源研發(fā)葡萄醋產(chǎn)品不僅符合未來(lái)的市場(chǎng)發(fā)展方向，還減少了銷售新鮮葡萄的壓力。更重要的是，提供了深度加工和綜合利用葡萄的實(shí)用方法，為未來(lái)葡萄醋飲料的工業(yè)生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)核白葡萄，市售；高活性干酵母，深圳尚格酵母有限公司提供；乳酸菌，學(xué)院保藏；中科AS1.41活性醋酸桿菌，上海佳民釀造食品有限公司提供；果膠酶（50 000 U/g），（食品級(jí)），上海祁邦實(shí)業(yè)有限公司提供；蔗糖（食品級(jí)），符合GB/T 317—2006標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器和設(shè)備

HPS-250型生化培養(yǎng)箱，黑龍江月東電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-2型恒溫水浴鍋，北京市山島儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司產(chǎn)品；WYT型手持糖度儀，成都光學(xué)廠產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)，江蘇億達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)核白果醋制備工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）原料預(yù)處理[7]。甄選葡萄粒，清洗揉碎，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的異維C鈉溶液以進(jìn)行顏色保護(hù)。

（2）果膠酶處理。將0.1%果膠酶加入帶有葡萄果皮的果汁中，于50℃下保持1 h，然后加熱至70～80℃以滅活果膠酶10 min，增加果汁產(chǎn)量，這有助于提升在后發(fā)酵時(shí)菌體與果汁的接觸率。

（3）成分調(diào)整。如果未涉及發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，則每千克糖可以生產(chǎn)約0.67 kg醋酸，可以通過(guò)預(yù)期的酒精含量添加蔗糖來(lái)調(diào)節(jié)葡萄汁的糖含量。加入檸檬酸，將發(fā)酵原料的酸含量調(diào)節(jié)至0.8%～1.2%。將調(diào)整后無(wú)核白葡萄果汁裝入容器中，于65℃水浴條件下進(jìn)行滅菌處理0.5 h。

（4）酵母活化。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～5%的蔗糖溶液，煮沸，將其冷卻至35～40℃，加入活性干酵母，水化處理15～20 min，溫度冷卻至34℃，活化2 h后存儲(chǔ)[8]。

（5）混菌酒精發(fā)酵。按比例量取酵母菌和乳酸菌，以一定的比例與無(wú)核白葡萄汁混合，于37℃水浴中溫育，直到出現(xiàn)了大量氣泡后才能活化，將其接種到處理過(guò)的果汁中并在合適的溫度下發(fā)酵。當(dāng)液面無(wú)氣泡產(chǎn)生標(biāo)志著發(fā)酵完成[9]。

（6）醋酸發(fā)酵。將保存在斜面上的醋酸菌接種到含有醋酸菌的活化培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)24 h，然后用顯微鏡檢查，確保細(xì)菌良好。細(xì)菌數(shù)量增加10%后，將酒精發(fā)酵液和醋酸菌種子混合均勻置于33℃的環(huán)境中。發(fā)酵完成后，進(jìn)行粗過(guò)濾和用澄清劑的澄清。

1.3.3 混菌酒精發(fā)酵試驗(yàn)

將滅菌后的無(wú)核白葡萄原液，冷卻至室溫后，按5%總接種量接入擴(kuò)培后的酵母菌和乳酸菌，2種菌分別按4∶1，3∶2，1∶1，2∶3，1∶4（V/V）的比例混合，用紗布封口，30℃下恒溫靜置發(fā)酵，定期觀察發(fā)酵液的變化情況，并規(guī)律地測(cè)定發(fā)酵液酒精含量，糖分占比等參數(shù)確定適宜的混合菌配比。

酵母菌與乳酸菌的總接種量分別為1%，3%，5%，7%，9%。在設(shè)定的條件下發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束，最后檢測(cè)發(fā)酵液中酒精含量可知酵母和乳酸菌最佳配比的數(shù)值[10-11]。

1.3.4 無(wú)核白果醋發(fā)酵單因素試驗(yàn)

分別選取醋酸菌接種量（5%，8%，10%，12%，15%，20%）、初始酒精度（3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%）、發(fā)酵的溫度（22，25，28，30，32，35℃）、發(fā) 酵 液pH值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5）對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)發(fā)酵液中酸的總含量確定適宜的發(fā)酵條件，便于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.5 無(wú)核白果醋發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素測(cè)試結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用發(fā)酵后測(cè)得的酸的總含量為響應(yīng)值，選取接種量（X1）、初始酒精含量（X2）和發(fā)酵的溫度（X3）為響應(yīng)值面分析因素，設(shè)計(jì)了三因素三水平，一共15個(gè)測(cè)試點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.6 測(cè)定方法

酸的總含量測(cè)定，NaOH滴定法（GB 7698—2014）；酒精度，蒸餾比重法；pH值的測(cè)定，PHS-3C型pH計(jì)；可溶性固形物，手持糖度計(jì)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌酒精發(fā)酵過(guò)程試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酵母菌和乳酸菌接種配比的優(yōu)化

酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 酵母菌與乳酸菌最佳配比試驗(yàn)

由表1可知，當(dāng)酵母和乳酸菌的配比為3∶2時(shí)，測(cè)得的酒精度為7.8%，此時(shí)為最高含量為總酸含量為3.6 g/L，最小殘?zhí)呛繛?.1 g/L，其他比例產(chǎn)生的酒精相對(duì)較低，因此可以確定酵母和乳酸菌的最佳配比為3∶2。

2.1.2 酵母菌和乳酸菌接種量的優(yōu)化

菌種接種量對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程的影響見(jiàn)圖1。

圖1 菌種接種量對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程的影響

由圖1可知，接種1%的酵母時(shí)，由于接種量過(guò)低，酵母繁殖緩慢，容易生長(zhǎng)細(xì)菌，進(jìn)而造成發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生較少的酒精；當(dāng)接種的酵母為5%或7%時(shí)，發(fā)酵達(dá)到7 d時(shí)，產(chǎn)生的酒精度低于3%接種產(chǎn)生的酒精含量?？赡苁怯捎诮湍附臃N量過(guò)高，容易產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，從而影響正常的發(fā)酵過(guò)程。因此，可以確定混合發(fā)酵時(shí)的細(xì)菌接種總量為5%，其中酵母接種量為3%，乳酸菌接種量為2%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 醋酸菌接種量對(duì)無(wú)核白果醋發(fā)酵的影響

醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 醋酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸率的影響

由圖2可知，5%的醋酸菌接種量不足以使得發(fā)酵快速完成，所需時(shí)間較長(zhǎng)。酸生成速度慢，發(fā)酵完成的時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)酵全部完成時(shí)的酸的總量也很低。當(dāng)大于10%的接種量時(shí)早期產(chǎn)酸速度高，隨著時(shí)間的推移，后期菌體代謝能力降低生長(zhǎng)速度放緩慢，對(duì)于發(fā)酵整體不易調(diào)控。在接種量為8%～10%時(shí)酸的生長(zhǎng)數(shù)量十分迅速，在完成總體發(fā)酵時(shí)酸總量也十分高。接種量不大時(shí)菌體的生長(zhǎng)速度慢，發(fā)酵周期也會(huì)受到影響，進(jìn)而影響生產(chǎn)效率，所需的成本較高；相反，接種量大的菌體生產(chǎn)旺盛，菌種的壽命縮短，前期營(yíng)養(yǎng)的消耗較大，影響到材料的轉(zhuǎn)化效率，所需的經(jīng)濟(jì)成本也過(guò)大。只有在接種量適中的區(qū)間，菌體生長(zhǎng)能縮短發(fā)酵所需要時(shí)間，使發(fā)酵過(guò)程中盡量不會(huì)被污染，整體增加產(chǎn)品的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)品質(zhì)量。在研究無(wú)核白葡萄果醋發(fā)酵的影響條件中，醋酸菌接種量最合適的范圍是8%～10%。

2.2.2 發(fā)酵液初始酒精度對(duì)無(wú)核白果醋發(fā)酵的影響

初始酒精度與總酸含量之間的關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 初始酒精度與總酸含量之間的關(guān)系

由圖3可知，開(kāi)始發(fā)酵的酒精度越高，間接影響著總酸生成量?？偹岷侩S著一開(kāi)始的酒精度數(shù)升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，在7%（V/V）時(shí)可達(dá)到最大值，此時(shí)的數(shù)值為6 g/100 mL。原因可以歸結(jié)為酒精度數(shù)有助于菌的生成，為菌的生長(zhǎng)提供了良好的生存環(huán)境。由圖3可知，7%是最合適的酒精度數(shù)。

2.2.3 醋酸發(fā)酵溫度對(duì)無(wú)核白果醋發(fā)酵的影響

醋酸發(fā)酵溫度與總酸含量之間的關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖4 醋酸發(fā)酵溫度與總酸含量之間的關(guān)系

由圖4所知，溫度對(duì)總酸的含量有著十分重要的影響，溫度越高分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，但是這個(gè)影響并不是一直正相關(guān)，轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在30℃，大于這個(gè)溫度，酸的總量不會(huì)迅速增長(zhǎng)。由圖4可知，總酸含量增速降低，29℃為最適溫度。

2.2.4 發(fā)酵液pH值對(duì)無(wú)核白果醋發(fā)酵的影響

發(fā)酵液pH值對(duì)總酸含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵液pH值對(duì)總酸含量的影響

由圖5可知，當(dāng)醋酸菌在菌落環(huán)境pH值為3.5時(shí)，底酸濃度太高的話不利于醋酸菌生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致在6 d以后醋酸菌不再繁殖，轉(zhuǎn)化率幾乎不再增長(zhǎng)；而當(dāng)pH值為5.5時(shí)，在6 d以后產(chǎn)酸量反而逐漸降低，原因可能是出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)氧化現(xiàn)象。因此最優(yōu)的初始pH值應(yīng)在4.0～5.0。

此模型用來(lái)探究影響試驗(yàn)的條件具體硬性的效果如何。

Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析見(jiàn)表4。

表4 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化醋酸發(fā)酵結(jié)果

探究無(wú)核白果醋發(fā)酵最合適條件，響應(yīng)值設(shè)定為總酸含量。通過(guò)響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)三因素三水平分析試驗(yàn)。

Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)測(cè)定結(jié)果建立相關(guān)的數(shù)學(xué)模型為：

由表4可知，模型的Prob＞F項(xiàng)小于0.05（數(shù)據(jù)＜0.0001），說(shuō)明處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果十分突出，當(dāng)X1、X2、X3的Prob＞F值小于0.01，無(wú)核白葡萄果醋發(fā)酵總酸含量與醋酸菌的接種量、初始酒精度和發(fā)酵的溫度呈正相關(guān)。當(dāng)Prob＞F值為＞0.01（為0.058 8），失擬項(xiàng)不明顯，選擇擬合模型。此外，利用軟件計(jì)算顯示相關(guān)模型系數(shù)R2=98.32%，大于90%。模型預(yù)判貼近，通過(guò)軟件分析得到相關(guān)變異系數(shù)（CV），變異系數(shù)反映模型的置信度，CV值越低模型的執(zhí)行度越高，試驗(yàn)的CV值為2.66%。說(shuō)明此模型具有指導(dǎo)價(jià)值，可以進(jìn)一步研究應(yīng)用。

2.3.2 無(wú)核白醋酸發(fā)酵試驗(yàn)的響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化[12]各因素相互作用對(duì)醋酸發(fā)酵的曲面響應(yīng)圖見(jiàn)圖6。

圖6 各因素相互作用對(duì)醋酸發(fā)酵的響應(yīng)曲面圖

由圖6（a）可知，發(fā)酵液酸的含量大的菌種條件分別為接種量為10%，初始酒精度為6%。由圖6（b）可知，接種量為10%時(shí)，發(fā)酵溫度為28.96℃時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量達(dá)到最大值。由圖6（c）可知，初始酒精度為6%時(shí)，發(fā)酵溫度為28.96℃時(shí)，總酸最多。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，得出醋酸發(fā)酵的最佳條件為接種量10%，初始酒精度6%，發(fā)酵溫度28.96℃，依據(jù)模型方程預(yù)測(cè)得到發(fā)酵液總酸含量6.65 g/100 mL。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)此模型可靠性，根據(jù)試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)接種量、初始酒精度及發(fā)酵溫度進(jìn)行微調(diào)，選擇10%接種量，6%初始酒精度，28.5℃環(huán)境溫度作為發(fā)酵過(guò)程的外界條件操作試驗(yàn)，最終發(fā)酵液中總酸含量為6.67 g/100 mL，與模型預(yù)測(cè)的值（6.65 g/100 mL）相差較小，說(shuō)明了回歸方程對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面軟件探究了無(wú)核白葡萄果醋醋酸發(fā)酵條件的影響值，利用模型最終確定接種量為10%，初始酒精度為6%，溫度為28.5℃。發(fā)酵完成后發(fā)酵液中的總酸含量為6.67 g/100 mL。同時(shí)，發(fā)酵中途加入乳酸菌多菌種的共同發(fā)酵，能提高體系中風(fēng)味物質(zhì)的含量，進(jìn)而使得后期生產(chǎn)的飲料口感更好?；炀l(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果表明，釀酒酵母和乳酸菌的總菌接種量為5%，接種比例為3∶2時(shí)，發(fā)酵效果最佳。