瓊脂覆蓋法防止菌落蔓延生長(zhǎng)的可行性探究

田 霞，王春林，余 為，劉琪雯

（重慶市黔江食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 409003）

菌數(shù)總數(shù)作為食品微生物學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)項(xiàng)目，對(duì)食品安全起著至關(guān)重要的作用。菌落總數(shù)可以用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)[1]。如果食品菌落總數(shù)超標(biāo)，說(shuō)明該食品的衛(wèi)生質(zhì)量達(dá)不到基本的衛(wèi)生要求，因?yàn)榇罅康募?xì)菌能夠破壞食品中的營(yíng)養(yǎng)成分，加速食品的腐敗變質(zhì)。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品種類更加豐富，生產(chǎn)原料品種來(lái)源更廣泛，加工工藝也更復(fù)雜，但微生物的污染仍然無(wú)法避免，尤其是糕點(diǎn)、面點(diǎn)等含高淀粉類食品受芽孢桿菌污染的概率大[2-5]，產(chǎn)品加工過(guò)程中滅菌不徹底，菌落計(jì)數(shù)時(shí)平板上容易出現(xiàn)菌落彌漫生長(zhǎng)的現(xiàn)象，導(dǎo)致菌落無(wú)法計(jì)數(shù)，對(duì)菌落總數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性造成嚴(yán)重的影響[6]。本文采用瓊脂覆蓋法，即在樣品和培養(yǎng)基混勻凝固后，再在其表面加蓋一薄層（約4 mL）平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)比不覆蓋檢驗(yàn)方法，對(duì)覆蓋法的有效性進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月餅：重慶渝東南片區(qū)（黔江、彭水、酉陽(yáng)、秀山）市售月餅50批，其中廣式月餅47批，滇式月餅2批，臺(tái)式月餅1批。

培養(yǎng)基：磷酸鹽緩沖液（201108），購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（211201），購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海和呈儀器制造有限公司；HH.B11-500-BS-Ⅱ 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LDZM-80KCS-III立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及樣品制備

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)菌稱取樣品25 g加入225 mL的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，即得到1∶10的稀釋樣品勻液，再無(wú)菌吸取1∶10樣品勻液1 mL加入9 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，即得到1∶100的稀釋樣品勻液，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液1∶1 000、1∶10 000。每次遞增一個(gè)稀釋度，更換1 mL無(wú)菌的刻度吸管，估計(jì)樣品的污染狀況程度，選擇3個(gè)連續(xù)的稀釋度，每個(gè)稀釋度覆蓋組做2個(gè)平板，不覆蓋組做2個(gè)平板。同時(shí)做空白對(duì)照組，即吸取無(wú)菌稀釋液1 mL至無(wú)菌平皿內(nèi)，做兩個(gè)平板。提前制備好平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，放置于48℃±2℃恒溫箱中保溫，及時(shí)傾注轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品勻液與培養(yǎng)基充分混勻，覆蓋組在培養(yǎng)基凝固后再均勻傾蓋約4 mL培養(yǎng)基。在短時(shí)間內(nèi)完成樣品的取樣、稀釋以及平板制備。

1.3.2 菌落培養(yǎng)及結(jié)果觀察

所有平板均倒置放于電熱恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果并進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)與菌落數(shù)量。菌落結(jié)果選取個(gè)數(shù)在30～300 CFU、無(wú)蔓延生長(zhǎng)情況的平板計(jì)數(shù)，個(gè)數(shù)小于30的平板則記下具體菌落個(gè)數(shù)，個(gè)數(shù)大于300的平板記結(jié)果為多不可計(jì)；若出現(xiàn)較大片狀菌落生長(zhǎng)的平板時(shí)，則不能采用，以另一個(gè)無(wú)片狀生長(zhǎng)的平板的菌落個(gè)數(shù)作為此稀釋度的菌落數(shù)；若菌落蔓延的生長(zhǎng)未占到一半的平板，而剩下的一半平板菌落又很均勻地分布，則可以用均勻分布的半個(gè)平板的菌落數(shù)乘以2，作為這一個(gè)平板的菌落總個(gè)數(shù)。菌落總數(shù)結(jié)果以稀釋度平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)表示，即每克中菌落總數(shù)個(gè)數(shù)（CFU·g-1）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

（1）不加覆蓋組。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，制成檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板后培養(yǎng)基不加覆蓋。

（2）加覆蓋組。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，制成檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板后，再在其表面加入一薄層平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），即加覆蓋。

（3）空白對(duì)照組。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，覆蓋和不覆蓋均做兩個(gè)平板。覆蓋組和不覆蓋組生長(zhǎng)結(jié)果均為無(wú)菌生長(zhǎng)，則此次試驗(yàn)有效。

2 結(jié)果與分析

計(jì)數(shù)每個(gè)樣品各個(gè)稀釋度、兩個(gè)組的檢驗(yàn)平板的菌落蔓延情況，再計(jì)數(shù)不蔓延檢驗(yàn)平板的菌落數(shù)量。空白對(duì)照組平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)。50批月餅樣品均為熱加工工藝，兩組均有5批月餅菌落總數(shù)小于10 CFU·g-1，1批月餅菌落總數(shù)值110 000，大于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 糕點(diǎn)、面包》最高安全限量（M=100 000 CFU·g-1），產(chǎn)品菌落總數(shù)項(xiàng)目不符合國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，即不合格。檢驗(yàn)平板蔓延均出現(xiàn)在1∶10稀釋度，蔓延生長(zhǎng)的月餅樣品地方派式有廣式和滇式，此次覆蓋組與不覆蓋組的菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果中位值均為150，50批樣品基本信息及菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果情況見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)50批月餅樣品覆蓋與不覆蓋組菌落蔓延情況，見(jiàn)表2。

表1 50批樣品基本信息及菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果情況表

表2 50批月餅樣品覆蓋與不覆蓋組菌落蔓延情況統(tǒng)計(jì)表

從表2中可以看出覆蓋組和不覆蓋組兩種檢驗(yàn)方法有顯著性差異，不覆蓋組出現(xiàn)菌落蔓延情況比較嚴(yán)重，蔓延平板占比34%，覆蓋組能很大程度控制菌落蔓延生長(zhǎng)，蔓延平板占比降低為12%。蔓延生長(zhǎng)的平板在菌落結(jié)果計(jì)數(shù)有時(shí)不宜采用，有時(shí)以平板的一半菌落數(shù)乘以2計(jì)數(shù)，極大地影響了菌落總數(shù)的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。雖然實(shí)際應(yīng)用中依然有個(gè)別平板蔓延生長(zhǎng)的情況出現(xiàn)，但總體而言，覆蓋法能有效改善平菌落蔓延生長(zhǎng)問(wèn)題，研究人員在實(shí)際工作中可以適當(dāng)采用。

3 結(jié)論與討論

月餅作為我國(guó)特有的傳統(tǒng)焙烤食品，其因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在生產(chǎn)和儲(chǔ)存期間極易受微生物污染而腐敗變質(zhì)。菌落總數(shù)作為食品檢測(cè)基礎(chǔ)性指標(biāo)，一定程度上能反映月餅的食品衛(wèi)生質(zhì)量情況。從近年來(lái)市售月餅質(zhì)量抽查結(jié)果中可以看出，菌落總數(shù)是月餅質(zhì)量的主要安全問(wèn)題之一[7]，且市售月餅的菌落總數(shù)項(xiàng)目合格率很難大幅度提高[8]。市場(chǎng)上消費(fèi)較多的廣式月餅含有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是芽孢桿菌和球菌[9]，而芽孢桿菌極易引起菌落總數(shù)測(cè)定時(shí)蔓延生長(zhǎng)，影響菌落總數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。有研究指出可以在瓊脂中加入0.2%～0.3%的TTC防止菌落出現(xiàn)彌漫現(xiàn)象[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)檢驗(yàn)平板做好后再在其表面覆蓋5 mL瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的培養(yǎng)基（配方：瓊脂20 g，水980 g），比在培養(yǎng)皿皿蓋中放置兩層濾紙的方法和每100 mLPCA培養(yǎng)基中加入2.5 mL 0.1%TTC溶液混勻的方法更能降低菌落蔓延對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響[11]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2022）即將實(shí)施，相較于2016年版，其菌落總數(shù)結(jié)果報(bào)告中刪除了“若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延”這一項(xiàng)情況，這要求檢驗(yàn)員更為準(zhǔn)確地預(yù)判樣品中是否含有在培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)的菌落，從而選擇適宜的菌落總數(shù)測(cè)定方法。培養(yǎng)基的菌落蔓延生長(zhǎng)是由于培養(yǎng)基表面游離水而助力細(xì)菌游動(dòng)所形成，各個(gè)文獻(xiàn)方法均是旨在減少其影響，從而降低菌落蔓延生長(zhǎng)情況。本次研究中的覆蓋法能大大減少平板菌落蔓延生長(zhǎng)的情況出現(xiàn)，但此次研究食品種類較為單一，以后的研究可以擴(kuò)大食品類別。覆蓋法不失為一種簡(jiǎn)便有效降低菌落蔓延生長(zhǎng)的方法，但仍然有個(gè)別平板蔓延情況發(fā)生，導(dǎo)致菌落計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)人員可依據(jù)檢驗(yàn)產(chǎn)品和目的選擇合適抑制菌落蔓延生長(zhǎng)的檢驗(yàn)方法。