非洲豬瘟病毒的不同病原學檢測方法比較

付玉亮

（山東省臨沂市蘭陵縣動物疫病預防控制中心，山東臨沂 277700）

非洲豬瘟最早起源于非洲，是世界動物衛(wèi)生組織要求必須上報的傳染病之一。自1921年以來，非洲豬瘟病毒在撒哈拉以南非洲國家和撒丁島肆虐，該病的流行對養(yǎng)豬業(yè)和社會經濟造成巨大影響。后來疫情陸續(xù)蔓延至歐洲、南美洲、歐亞交界等地，后又傳入俄羅斯、烏克蘭、波蘭、意大利等國家，2014年立陶宛和波蘭報道非洲豬瘟感染野豬的病例。2017年非洲豬瘟病毒在羅馬尼亞和捷克共和國流行，2018年在保加利亞、匈牙利、比利時流行，同時，2018年8月我國也發(fā)生非洲豬瘟疫情。

從世界各國對非洲豬瘟的防控經驗來看，目前該病只能通過流行病學監(jiān)測、撲殺、無害化處理等措施處理，同時，需要提高生豬調運監(jiān)管、生物安全措施，嚴格檢疫等。不管是在生豬飼養(yǎng)環(huán)節(jié)，還是在生豬屠宰環(huán)節(jié)，監(jiān)測預警尤為重要，是進行緊急處置的前提，要想做到“早、快、嚴、小”（即早發(fā)現、快處理、嚴格執(zhí)行防控措施、損失最小）的處置原則，必須進行快速、準確的非洲豬瘟病毒診斷。

目前市場上已有多種可用的針對非洲豬瘟病毒的診斷試劑和診斷方法。常用的檢測方法包括普通PCR、熒光定量PCR、LAMP等。2018年底、2019年初，中國動物疫病預防控制中心組織開展了第一次、第二次非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價工作，對熒光定量PCR類、等溫擴增類、試紙條類檢測試劑進行了比對評價，有26家生產商共30余個檢測試劑產品可用于非洲豬瘟現場快速檢測。本文對不同的非洲豬瘟病原學檢測方法進行簡單闡述，分析不同方法之間的優(yōu)缺點，以期為準確診斷及監(jiān)測非洲豬瘟病毒提供參考。

1 非洲豬瘟在我國的流行概況

非洲豬瘟病原為非洲豬瘟病毒（ASFV），ASFV為大型雙鏈DNA病毒，具有包膜。根據非洲豬瘟病毒編碼衣殼蛋白p72的B646L基因可將非洲豬瘟病毒分為24種基因型[1]。病毒基因組在170至193 kbp間變化，編碼150～167種蛋白。非洲豬瘟病毒感染家豬和野豬，鈍緣軟蜱是該病毒的生物媒介，可以長期感染帶毒，并成為重要的傳染源，類似于病毒庫。

非洲豬瘟病毒主要通過接觸傳播，易感動物接觸染疫動物或被病毒污染的飼料、水、環(huán)境等可造成感染，有氣溶膠短距離傳播的可能。此外，人類活動是造成非洲豬瘟病毒傳播的重要因素，生豬調運、豬肉加工運輸等可造成該病毒快速、遠距離傳播。

非洲豬瘟的臨床癥狀與很多疾病相似，加上低毒力毒株的流行，發(fā)病后的生豬沒有典型癥狀，很容易與其他疾病混淆，這導致早期診斷困難，甚至在采取疫病控制措施之前病毒可能已經蔓延。

2018年8月，我國遼寧首次出現了非洲豬瘟疫情。農業(yè)農村部第一時間啟動應急響應，對發(fā)病豬群進行了處理，雖然采取了撲殺、無害化處理等合理的綜合防控措施，但疫情仍然迅速向全國各地蔓延，且傳播速度很快。截至2018年12月31日，我國共報告家豬疫情97起，野豬疫情2起；2019年發(fā)生家豬疫情60起、野豬疫情3起；2020年發(fā)生家豬疫情18起、野豬疫情1起，2021年截至12月1日，發(fā)生家豬疫情14起。2018年發(fā)生的多起非洲豬瘟疫情與泔水飼喂、人員和車輛的流動有關，2019年、2020年生豬調運引發(fā)的疫情略有上升。

2 非洲豬瘟病毒的分離

非洲豬瘟病毒分離鑒定主要采用紅細胞吸附試驗。20世紀60年代Malmquist、Hay發(fā)現豬感染非洲豬瘟病毒的白細胞可以吸附紅細胞，并于吸附后48 h裂解；而豬的其他任何病毒都不具有這個特性。因此該檢測方法具有較高的特異性，時至今日仍是非洲豬瘟病毒檢測的重要病原學檢測方法。

3 病原快速檢測方法

3.1 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（Real-time PCR）從20世紀90年代開始快速發(fā)展，目前，實時熒光定量PCR是檢測非洲豬瘟病毒最靈敏且廣泛應用的方法。實時熒光定量PCR是在普通PCR的基礎上，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號對反應進程實現實時監(jiān)測，實現從定性到定量。熒光定量PCR對核酸檢測的敏感性更高，特異性和檢測效率也得到了提高，是普通PCR的升級技術。

世界動物衛(wèi)生組織推薦的熒光定量PCR檢測技術是根據非洲豬瘟病毒基因組中的保守序列B646L基因（編碼p72蛋白）設計探針來進行病毒基因擴增，現在已建立多種病毒基因的熒光定量PCR檢測，例如廣州華醫(yī)測檢測科技有限公司與廣州悅洋生物技術有限公司一起研究開發(fā)的非洲豬瘟病毒p72和CD2v雙基因實時熒光定量PCR檢測方法，其擴增效率在90%～110%，最低檢出限為7.3～24.5 copies/μL，有很好的敏感性和特異性[2]。此外，還有研究者開發(fā)了多重熒光PCR檢測方法用于不同豬病的鑒別診斷，如華中農業(yè)大學牛偉杰等[3]根據非洲豬瘟病毒、經典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的保守基因序列設計了三重熒光PCR引物進行多個病毒基因的檢測，該方法有利于臨床高效的鑒別診斷。

3.2 等溫擴增技術

等溫擴增技術（Isothermal amplification technology,IAT）也是一種新型的核酸體外擴增技術，等溫擴增技術包括環(huán)介導等溫擴增技術、交叉引物擴增技術、熒光重組酶介導等溫擴增技術等。

3.2.1 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是國外學者在21世紀初研究開發(fā)的一種恒溫核酸擴增方法，其反應條件簡單，檢測結果肉眼即可判斷[4]。

LAMP技術已廣泛應用于食品安全的病原微生物檢測、動植物疫病診斷以及人類許多疾病的檢測中。如章小洪等[5]將LAMP技術用于食品中沙門氏菌的檢測，呂觀等[6]將LAMP技術用于牛肉中金黃色葡萄球菌，而在非洲豬瘟病毒檢測方面，王彩霞等[7]、James等[8]已研究報道了非洲豬瘟病毒LAMP檢測技術。

3.2.2 交叉引物擴增技術

交叉引物擴增（Crossing priming amplification,CPA）技術是我國第一個具有自主知識產權的核酸擴增技術[9]。交叉引物擴增需要設計3～8條互補引物，設計的引物可識別DNA中的特定位點，并使用具有等溫效應的聚合酶進行擴增。根據設計的引物數量，可將交叉引物擴增分為雙交叉擴增和單交叉擴增，在Bst DNA聚合酶作用下進行目的片段延伸，不斷循環(huán)雜交以得到大量擴增產物，擴增產物添加熒光染料后置于紫外光下觀察，陽性樣品可觀察到熒光，陰性樣品不顯示任何熒光。交叉引物擴增已被用于肺結核、雞呼腸孤病毒、雞腺病毒及牛腹瀉病毒等病原的檢測。Fr czyk等[10]開發(fā)了用于非洲豬瘟病毒檢測的CPA技術，可直接用于檢測家豬或野豬血液和血清中非洲豬瘟病毒的DNA片段，無需提取核酸。該方法具有很好的特異性和很高的靈敏，檢測結果與實時熒光定量PCR檢測結果一致。

3.2.3 熒光重組酶介導等溫擴增技術

熒光重組酶介導等溫核酸擴增技術（Recombinase aided amplification,RAA）主要利用重組酶、DNA聚合酶等在39℃等溫條件下進行核酸擴增。趙凱穎等[11]選取非洲豬瘟病毒保守基因B646序列為靶基因建立了實時熒光重組酶介導等溫擴增方法，采用50 μL反應體系在等溫條件下進行擴增，檢測結果與實時熒光定量PCR檢測結果一致。

4 不同病原學檢測方法的優(yōu)缺點

病毒分離進行紅細胞吸附試驗仍然是病原學最敏感的檢測技術，但該方法對實驗室人員、實驗室條件及生物安全等條件要求嚴格，只能在特定的實驗室開展，基層獸醫(yī)實驗室不能開展。紅細胞吸附試驗具有很高的特異性，但實驗要求高且費時費力。實時熒光定量PCR檢測技術特異性好、靈敏度高，但實驗條件及儀器設備要求高，需要PCR儀、核酸提取儀等儀器設備，對實驗室人員素質也有要求。

環(huán)介導等溫擴增檢測技術特異性強、敏感性高，不需要PCR儀等昂貴的儀器且檢測時間短，結果判讀簡單易操作，可通過肉眼或電泳或比濁儀進行判定。但其引物的設計較復雜，且不能擴增較長的目的片段，易出現假陽性。交叉引物等溫擴增操作簡單，只需要在水浴鍋內即可完成擴增，但該檢測方法不穩(wěn)定，反應體系復雜，也有假陽性出現。環(huán)介導等溫擴增和交叉引物擴增2種檢測方法的特異性沒有顯著差異，但靈敏度有差異，環(huán)介導等溫擴增的靈敏度達到90%，而交叉引物擴增的靈敏度為70%，靈敏度都有待提高[12]。等溫擴增技術操作簡單，不需要昂貴的儀器設備，但氣溶膠污染的風險較高。

5 小結

我國通過撲殺陽性豬群并做無害化處理，執(zhí)行嚴格的消毒，通過排查和監(jiān)測及時發(fā)現可疑病例及時處置；同時加強生豬調運監(jiān)管，生豬跨省調運實行嚴格的檢測和“點對點調運”等，使非洲豬瘟疫情得以控制。自非洲豬瘟疫情發(fā)生至今，我國的疫情發(fā)生數量逐年下降，但不可否認的是非洲豬瘟病毒已在我國“定殖”，實行非洲豬瘟病毒清除計劃將是一項艱巨的任務和挑戰(zhàn)。

非洲豬瘟病毒檢測已成為基層獸醫(yī)隊伍的一項長期工作，在進行疫病防控時，可靠和快速的診斷對于防止疫情蔓延至關重要。世界動物衛(wèi)生組織推薦的非洲豬瘟檢測方法包括病毒分離、熒光PCR、ELISA等。實時熒光PCR應用最廣泛，其靈敏度和特異性均可滿足檢測的需要，但檢測成本較高，等溫擴增檢測技術作為低成本的快速檢測方法，在某些場合可作為熒光定量PCR檢測法的替代方案。