黃瑩瑩 李海朋 裴 浩

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)來源于口腔上皮細胞，是頭頸部最常見的惡性腫瘤，已被列為世界第八大惡性腫瘤，由于其具有高發(fā)生率、高致死率和高轉(zhuǎn)移率，所以O(shè)SCC一直都是臨床工作者的關(guān)注重點。層粘連蛋白γ2(laminin γ2 chain gene，LAMC2)是層粘連蛋白家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)，LAMC2在食管鱗癌中高表達[1]，此外，LAMC2可增強卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，通過調(diào)節(jié)細胞賴以生存的微環(huán)境的pH值，促進胰腺癌細胞的清洗和遷移[2-3]。血清LAMC2可作為肝癌預(yù)后的診斷標志物[4]。Wang等研究報道稱人OSCC細胞分泌的細胞外囊泡中富集大量LAMC2，可促進體外淋巴管再生[5]，但該基因?qū)Π┘毎膼盒孕袨閷W(xué)的影響未進行探討，因此本研究以人舌鱗癌細胞TSCC為研究對象，探討LAMC2對癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，旨在為臨床治療OSCC提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人OSCC細胞CAL-27購自中科院上海細胞研究所。

1.2 試劑與儀器

含有si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2、LAMC2-NC的pcDNA3.1重組質(zhì)粒購自上海吉瑪生物科技有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM購自美國Thermo公司；MTT試劑盒購自美國Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及PCR引物購自大連寶生物工程有限公司；神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin，N-cad)、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；多功能酶標儀購自美國Bio-TEK公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將CAL-27細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，并傳代，待細胞傳至第4代時用于實驗。

將對數(shù)生長期的細胞重懸，制成細胞密度為1×105的細胞懸液，接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%時。將細胞隨機分為對照組、si-NC組、si-LAMC2組、LAMC2-NC組、LAMC2組。對照組細胞不做任何處理，其余4組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，待轉(zhuǎn)染成功率達到85%時，進行以下實驗。

1.4 qRT-PCR法檢測LAMC2的表達

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞，利用RNA試劑盒提取細胞中總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計算LAMC2的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 MTT法檢測細胞存活率

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞將細胞重懸，以5×103/個細胞/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換含有0.5% MTT溶液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔中加入100 μl DMSO，振蕩混勻后，置于酶標儀上測定波長570 nm處的吸光度(A值)，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

轉(zhuǎn)染48 h后，3000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，收集對數(shù)生長期的細胞。冰PBS清洗細胞2次，加入400 μl Binding Buffer將細胞重懸，加入5 μl annexin V避光反應(yīng)20 min，再加入4 μl碘化丙啶，振蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Transwell實驗檢測侵襲細胞數(shù)

轉(zhuǎn)染48 h后，無血清培養(yǎng)基將細胞重懸，制成密度為1×105個/ml的細胞懸液。將100 μl細胞懸液接種于經(jīng)Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉下室中的培養(yǎng)基，棉簽擦去上室膜上的細胞，甲醛固定下室中入侵的細胞，0.5%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.8 蛋白印跡法檢測細胞中E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，加入40 μl RIPA裂解液，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100 ℃煮沸10 min使蛋白處于穩(wěn)定狀態(tài)。凝膠電泳，每孔20 μl蛋白樣品，80 v電泳20 min，使蛋白樣品至分離膠后120 v恒壓電泳2 h，電泳結(jié)束后，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜3次，5 min/次，室溫封閉1 h，E-cad、N-cad、vimentin、GAPDH一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，ECL法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測結(jié)果

LAMC2表達組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組LAMC2表達降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組LAMC2表達升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組LAMC2表達升高(P<0.05)，見表2。

表2 LAMC2表達量比較

2.2 細胞存活率檢測結(jié)果

細胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細胞存活率降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細胞存活率升高(P<0.05)，見表3。

表3 細胞存活率比較

2.3 細胞凋亡率檢測結(jié)果

細胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細胞凋亡率降低(P<0.05)，見表4。

表4 細胞凋亡率比較

2.4 侵襲細胞數(shù)檢測結(jié)果

侵襲細胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組侵襲細胞數(shù)增多(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組侵襲細胞數(shù)增多(P<0.05)，見表5。

表5 侵襲細胞數(shù)比較

2.5 蛋白印跡法檢測結(jié)果

E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組E-cad蛋白相對表達量升高，N-cad、vimentin蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin蛋白相對表達量升高(P<0.05)。見表6、圖1。

表6 E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量比較

注：A為對照組;B為si-NC組;C為si-LAMC2組;D為LAMC2-NC組;E為LAMC2組。

3 討論

頭頸部常見的惡性腫瘤中，約90%以上為OSCC[6]，其病因包括遺傳、環(huán)境、感染等因素，好發(fā)于40～60歲煙酒嗜好者。目前對于OSCC的治療以手術(shù)、放化療及免疫治療為主，雖然治療手段已取得巨大進展，但患者5年生存率仍不理想，僅有50%[7]。OSCC可發(fā)生早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有極高的隱匿性，據(jù)統(tǒng)計，約40%患者早期即發(fā)生隱匿性頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，這可能與高病死率有關(guān)。因此尋找新的治療靶點對OSCC患者預(yù)后不良具有重要意義。

層粘連蛋白是一類大分子糖蛋白，主要存在于上皮細胞、神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞的基質(zhì)上，該分子蛋白通常由α鏈、β鏈和γ鏈組成，形成十字形結(jié)構(gòu)[8]。LAMC2、LAMB3、LAMA3三個亞基組成異三聚體糖蛋白層粘連蛋白5，特異性表達于上皮細胞，在上皮細胞的遷移過程中具有重要作用。LAMC2僅在層粘連蛋白5中存在，對層粘連蛋白5的生理功能具有重要作用。LACM2已被報道與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)LAMC2過表達可預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良，并促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。LAMC2在喉癌細胞和組織中高表達，且LAMC2表達水平與TNM分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化和總生存期相關(guān)，此外LAMC2顯著促進細胞增殖和細胞活力，可顯著逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗抑制喉癌細胞增殖的作用[10]。長鏈非編碼RNA00511通過海綿吸附于miR-765上調(diào)LAMC2的表達，促進舌鱗狀細胞癌的進展[11]。由此可見，LAMC2基因可能成為治療癌癥的新的治療靶點，但是LAMC2對OSCC癌細胞行為學(xué)的影響鮮有報道，因此本研究以CAL27細胞為研究對象，上調(diào)或敲降細胞中LAMC2的表達，檢測癌細胞的增殖、凋亡和侵襲能力。結(jié)果顯示：過表達LAMC2后癌細胞增殖和侵襲能力增強、凋亡率降低，敲降LAMC2的表達后，癌細胞增殖和侵襲能力減弱，凋亡率升高。結(jié)果提示：LAMC2促進OSCC的惡性行為學(xué)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程，發(fā)生在上皮細胞和間質(zhì)細胞之間，當上皮細胞受到某些刺激因素時，上皮細胞丟失原有特性，形態(tài)由原來的規(guī)則形態(tài)轉(zhuǎn)變成梭形的不規(guī)則形態(tài)，細胞骨架發(fā)生重構(gòu)排列，細胞極性改變，使其具有間質(zhì)細胞特性，極性改變提高細胞遷移能力，增強對周圍組織的侵襲[12]。該過程常發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織纖維化以及癌細胞遷移和侵襲過程，所以在多數(shù)腫瘤的遷移和侵襲中均發(fā)生上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)GIT1誘導(dǎo)EMT過程促進肝細胞癌遷移和侵襲。miR-29b抑制EMT過程可降低癌細胞遷移和侵襲能力，以及血管再生能力[14]。Okada等[15]報道稱LAMC2逆轉(zhuǎn)EMT過程可抑制胰腺癌的進展并增強化療藥物敏感性。發(fā)生EMT主要表現(xiàn)在上皮細胞表面標記蛋白E-cad表達下降，間質(zhì)細胞表面標記物N-cad和vimentin蛋白表達上升，E-cad屬于鈣粘蛋白家族成員，主要介導(dǎo)細胞間連接和黏附，N-cad和vimentin蛋白與癌細胞遷移侵襲、化療藥物耐藥、預(yù)后不良等密切相關(guān)。

既往研究表明，層粘連蛋白5的3個亞基LAMC2、LAMB3、LAMA3均可促進EMT過程從而癌細胞發(fā)生遷移和侵襲[16]。本研通過蛋白印跡法檢測LAMC2對OSCC細胞癌中E-cad、N-cad、vimentin蛋白表達情況。結(jié)果顯示：上調(diào)LAMC2后，E-cad蛋白表達降低，而N-cad和vimentin蛋白表達升高，敲降LAMC2后各蛋白表達出現(xiàn)相反趨勢。結(jié)果提示：LAMC2促進OSCC的EMT過程。

綜上所述，LAMC2促進OSCC癌細胞增殖和侵襲、抑制凋亡，其可能是通過誘導(dǎo)EMT過程發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床治療OSCC提供理論依據(jù)。