王喜梅 單艷華 夏建華

顱內(nèi)膠質(zhì)瘤也稱為腦膠質(zhì)瘤[1]，患者生存率極低，即使目前臨床上治療腦膠質(zhì)瘤的手段已有極大突破，但患者術(shù)后的生存率依舊未改善[2]。近年來，分子生物學(xué)在腫瘤的基因診斷和治療方面有了重大突破，利用微小RNA(miRNA)研究新型靶向藥物是目前的研究熱點(diǎn)。miRNA可通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路，對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)通路、p53通路及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)通路等[3]。miRNA在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制或促進(jìn)的作用[4]。miR-34在腫瘤細(xì)胞中呈較低的表達(dá)趨勢(shì)，通過對(duì)p53信號(hào)通路的調(diào)控，發(fā)揮抑癌作用。miR-194在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平下調(diào)，對(duì)Bmil基因和CDH2蛋白的表達(dá)均有抑制，從而發(fā)揮抑癌的作用[5]。本研究主要探究顱內(nèi)膠質(zhì)瘤組織中miR-34、miR-194表達(dá)與患者生存期的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年6月至2018年6月收治的92例行膠質(zhì)瘤切除手術(shù)的顱內(nèi)膠質(zhì)瘤患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《腦膠質(zhì)瘤診療規(guī)范(2018年版)》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②卡氏評(píng)分大于 80分；③第一次手術(shù)；④未經(jīng)放化療；⑤完成手術(shù)并出院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤疾??；②合并自身免疫??；③患者資料不完整。選取同期64例行顱內(nèi)減壓術(shù)的非惡性腫瘤患者為對(duì)照組。研究組患者男性49例，女性43例；年齡31～80歲，平均年齡(54.29±3.61)歲；根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類[7]，腦膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)36例，Ⅲ級(jí)29例，Ⅳ級(jí)20例。對(duì)照組患者男性38例，女性26例，年齡30～80歲，平均年齡(55.01±3.03)歲。2組研究對(duì)象性別、年齡等資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2 方法

檢查血清中miR-34和miR-194表達(dá)：采集研究組手術(shù)前后及對(duì)照組清晨空腹靜脈血9 ml，離心15 min，3000 r/min，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清中miR-34和miR-194的表達(dá)水平。操作步驟：取血清樣本，采用mirVanaTMPARISTM試劑盒(Ambion-560)提取血清中的RNA總量，使用超微量核算蛋白測(cè)定儀(ND-2000)檢測(cè)其RNA的濃度和純度，利用DNAaseⅠ酶除去血清中的DNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。加入miR-34、miR-194引物，探針序列為：has-miR-34：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU，has-miR-194：UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA。PCR反應(yīng)體系：4.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.5 μL TaqMan mircoRNA assay(5×)，5.0 μL TaqMan Mix。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱6 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min ，循環(huán)40次。采用相對(duì)定量法計(jì)算miR-34、miR-194相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究組手術(shù)前后及對(duì)照組血清中miR-34、miR-194的水平比較

研究組手術(shù)前血清中miR-34、miR-194水平均比對(duì)照組低(P<0.05)，手術(shù)后血清miR-34、miR-194水平均上升(P<0.05)，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 研究組手術(shù)前后及對(duì)照組血清中miR-34、miR-194水平對(duì)比

2.2 腦膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)患者手術(shù)后miR-34、miR-194水平比較

研究組患者根據(jù)WHO分級(jí)，將其分為腦膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)。92例腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后組織中的miR-34表達(dá)水平的平均值為1.35，miR-194表達(dá)水平的平均值為1.24，以此作為標(biāo)準(zhǔn)，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。Ⅰ級(jí)患者中miR-34、miR-194均為高表達(dá)；Ⅱ級(jí)中miR-34高表達(dá)有29例，miR-194高表達(dá)有28例；Ⅲ級(jí)中miR-34高表達(dá)有2例、miR-194高表達(dá)有4例；Ⅳ級(jí)中均為低表達(dá)。見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)患者手術(shù)后miR-34、miR-194水平比較/例

2.3 研究組患者術(shù)后生存期情況

通過為期3年的隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-34、miR-194高表達(dá)組患者術(shù)后6個(gè)月、1年、2年、3年生存率均高于低表達(dá)組(P<0.05)。見表3。

2.4 ROC曲線分析

經(jīng)ROC曲線可得，miR-34、miR-194預(yù)測(cè)患者存活期的AUC分別為0.809、0.764，miR-34、miR-194的截?cái)嘀捣謩e為2.11、2.05，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.882。見表4，圖1。

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種惡性的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中腦膠質(zhì)瘤占其40%～60%，目前在臨床上的治療方法主要是腫瘤切除術(shù)、放化療等[8]。由于該疾病具有較強(qiáng)的侵襲性，患者在手術(shù)后仍存在較高的復(fù)發(fā)可能性，患者的術(shù)后生存期僅有12～18個(gè)月。目前關(guān)于腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制尚未明確，并且該腫瘤的生長(zhǎng)呈浸潤(rùn)性，與正常組織無明顯界限，無法通過常規(guī)影像學(xué)、血常規(guī)等檢查方法診斷，因此探討膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評(píng)估的相關(guān)內(nèi)容具有意義[9]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，能對(duì)多種腫瘤的癌基因以及抑癌基因產(chǎn)生作用，其改變直接對(duì)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡產(chǎn)生影響[10]。miRNA水平的升高或降低引起的抑癌或促癌作用，會(huì)對(duì)腫瘤患者的病理特征、診斷及預(yù)后產(chǎn)生影響。在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高的miRNA可能與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系，而在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低的miRNA可能發(fā)揮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制[11]。表達(dá)下調(diào)的miRNA與腫瘤的臨床診斷具有相關(guān)性，在預(yù)測(cè)疾病發(fā)展方面具有高靈敏度和高特異度，其可能成為新型的強(qiáng)效的抗癌藥物，用以靶向治療腫瘤[12]。

miRNA-34家族包含miR-34a、miR-34b、miR-34c，具有較高保守性，存在于不同物種中。目前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-c在多種惡性腫瘤中表達(dá)下降，是抑癌因子p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，參與調(diào)控了p53信號(hào)通路，發(fā)揮抑制腫瘤的作用[13]。抑癌因子p53能夠抑制細(xì)胞的增殖，p53通路異常將引發(fā)多種腫瘤，其通過調(diào)節(jié)miRNA大方式去調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。癌基因、DNA損傷等刺激使p53信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA，從而發(fā)揮抑癌作用。已有大量研究表明，p53激活的miRNA中包括了miR-34，miR-34是p53的靶基因，受到p53的直接調(diào)控，且還可以對(duì)p53的某些活性調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生調(diào)控作用，參與p53的反饋調(diào)節(jié)[14]。關(guān)于miR-34家族的生物學(xué)功能研究，主要集中于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡及衰老的方面[15]。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，miR-34與靶基因結(jié)合并抑制其表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞衰老的作用，因此miR-34有可能成為老化的一種生物標(biāo)志物[16]。miR-34能夠抑制細(xì)胞的增殖，在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中起著抑癌的作用，其在膠質(zhì)瘤中的水平下降，是因?yàn)樵趩?dòng)子附近的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤島甲基化，使miR-34失去活性，從而在膠質(zhì)瘤中miR-34的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。在腫瘤細(xì)胞系中miR-34的表達(dá)水平下降，在恢復(fù)其表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移均受到抑制，表明miR-34產(chǎn)生抑癌作用并且抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲作用[17]。已證實(shí)miR-34對(duì)p53通路調(diào)控而產(chǎn)生抑癌作用，越來越多的研究更關(guān)注于是否能將miR-34開發(fā)為一種新型靶向藥物或檢測(cè)腫瘤的臨床手段。

miR-194在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中也承擔(dān)抑癌因子的作用，其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平下降，并且可以靶向調(diào)節(jié)b細(xì)胞特異單克隆鼠白血病毒整合位點(diǎn)基因-1(Bmi-1)，使該基因表達(dá)水平下降[18]。Bmi-1基因與神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、白血病干細(xì)胞的更新和增殖有密切關(guān)系，能明顯提高干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)和擴(kuò)增水平。在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Bmi-1基因表達(dá)水平較高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞不斷更新，發(fā)展為癌癥干細(xì)胞，Bmi-1還可以對(duì)腫瘤抑制基因產(chǎn)生負(fù)調(diào)控的作用，調(diào)控細(xì)胞的周期、凋亡及衰老。miR-194還與靶基因神經(jīng)鈣黏(CDH2)蛋白的表達(dá)水平存在相關(guān)性[19]。在腦膠質(zhì)瘤中，CDH2基因呈高度表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。miR-194在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，并結(jié)合靶基因CDH2，降低CDH2基因的水平。miR-194在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常腦組織細(xì)胞，若miR-194在細(xì)胞中過度表達(dá)，細(xì)胞的增殖能力顯著下降[20]。也有遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)表明，miR-194過度表達(dá)，細(xì)胞的遷移及侵襲能力均明顯下降，而凋亡實(shí)驗(yàn)表明，miR-194過度表達(dá)，細(xì)胞的凋亡率也增加[21]。多項(xiàng)研究均表明，miRNA-34、miR194在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，可以作為新型靶向藥物發(fā)展的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，研究組患者手術(shù)前的miR-34、miR-194表達(dá)較低，經(jīng)過手術(shù)腫瘤切除后，表達(dá)水平有所上升，但與對(duì)照組患者相比較，水平依舊偏低，說明miR-34、miR-194的表達(dá)與患者腫瘤的嚴(yán)重情況存在相關(guān)性。將研究組患者腫瘤分級(jí)，得到腦膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)，比較不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后的miR-34、miR-194的表達(dá)水平可以得到，腦膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，miR-34、miR-194的表達(dá)水平越低。根據(jù)miR-34的表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較2組間的生存情況，結(jié)果表明miR-34表達(dá)越高，則患者的存活率越高。根據(jù)miR-194的表達(dá)也分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，得到高表達(dá)組中6個(gè)月時(shí)有33例存活，1年有29例，2年有22例，3年有16例；低表達(dá)組中6個(gè)月有34例，1年有25例，2年有17例，3年有11例，表明miR-194表達(dá)越高，則患者的存活率也越高。比較組織中miR-34、miR-194的表達(dá)水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)顱內(nèi)膠質(zhì)瘤患者生存情況可得，將兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合，可提高預(yù)測(cè)顱內(nèi)膠質(zhì)瘤患者生存期的特異度及靈敏度。

綜上所述，顱內(nèi)膠質(zhì)瘤患者病情越嚴(yán)重，其血清中miR-34、miR-194的表達(dá)水平越低；且患者術(shù)后的miR-34、miR-194的水平越高，存活期越長(zhǎng)。ROC曲線顯示miR-34、miR-194的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)患者的生存期，且聯(lián)合預(yù)測(cè)價(jià)值更高。