周敬奎 楊艷兵 劉 亞

根據(jù)2018年WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)肺癌病例超過200萬人，因肺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過170萬[1]，而在我國(guó)肺癌的發(fā)病率位列所有惡性腫瘤第一位，且近年來患病人數(shù)呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢(shì)[2]。因其預(yù)后差等原因?qū)е缕洳∷缆矢?，患?5年內(nèi)的生存率極低，僅為 7%～14%[3]。早期肺癌由于發(fā)病隱匿，影像學(xué)診斷肺癌有一定的難度，造成患者錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)間而導(dǎo)致治療延誤[4]。因此尋找新的治療靶點(diǎn)來延長(zhǎng)肺癌患者的總生存期至關(guān)重要。CD44作為常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，參與多種腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程[5]。miRNA(microRNA)是一類由內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈 RNAs，長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸，主要在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)[6]。多種miRNA 與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，在腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的作用[7]。miR-98-5p與多種類型的癌癥，包括肺癌，結(jié)腸直腸癌和乳腺癌關(guān)系密切[8]。有研究報(bào)道m(xù)iR-98-5p參與抑制增殖，遷移和侵襲非小細(xì)胞肺癌[9]，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD44在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-98-5p表達(dá)水平，探討CD44和miR-98-5p在肺癌組織的表達(dá)及其與患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月至2018年1月本院收治肺癌患者69例作為研究對(duì)象，診斷依據(jù)《CSCO原發(fā)性肺癌診療指南(2016)》[10]，依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腫瘤進(jìn)行分期[11]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查、病理檢查確診為肺癌；②患者均為初診，未經(jīng)過放、化療，靶向治療及生物免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②合并肺部其他疾?。虎叟R床資料不全患者。研究組中男性45例，女性24例，年齡32～74歲，平均年齡(65.97±9.43)歲。研究對(duì)象及家屬均簽署研究知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中CD44表達(dá)情況

應(yīng)用SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)檢測(cè)腫瘤組織及癌旁組織中CD44表達(dá)情況，MAC30定位于細(xì)胞質(zhì)中，染色后呈棕黃色顆粒。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：按陽性細(xì)胞占比計(jì)分，<5%記0分、5%～25%記1分、26%～50%記2分、51%～75%記3分、>75%記4分。按著色程度計(jì)分，無染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。以兩者得分相乘為最終結(jié)果，>6分為高表達(dá)，≤6分為低表達(dá)。

1.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-98-5p表達(dá)水平

取腫瘤組織及癌旁組織樣本，使用TRIzol RNA試劑盒(購自賽默飛世爾科技有限公司)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)檢測(cè)總RNA 濃度及純度。取2 μg總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪

采用門診、微信、郵件等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，間隔3個(gè)月，以患者死亡或截止2021年5月終止隨訪，記錄肺癌患者總生存率和中位生存時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD44和miR-98-5p在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

結(jié)果顯示：CD44在肺癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-98-5p在肺癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 CD44和miR-98-5p在組織中的表達(dá)情況比較

2.2 CD44和miR-98-5p表達(dá)與肺癌組織臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示：CD44表達(dá)與患者年齡、性別、TNM分期及腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，miR-98-5p表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，而與TNM分期、腫瘤分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 CD44和miR-98-5p水平與患者臨床病理資料的關(guān)系/例

2.3 CD44和miR-98-5p水平與患者預(yù)后的關(guān)系

69例NSCLC患者死亡20例、存活45例、失訪2例，存活率65.22%，死亡患者均死于腫瘤復(fù)發(fā)或相關(guān)并發(fā)癥。采用Kaplan-Meier生存曲線分析CD44和miR-98-5p水平與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明CD44陽性表達(dá)的肺癌患者生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組織中miR-98-5p高表達(dá)的肺癌患者生存率明顯高于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 CD44和miR-98-5p表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系

3 討論

正常情況下，細(xì)胞自我更新調(diào)控受到嚴(yán)格的程序性控制，一旦發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后，將破壞細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制平衡，另外，由于腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、促使腫瘤形成以及維持腫瘤存在的特點(diǎn)，使得腫瘤產(chǎn)生異質(zhì)性，最終使得以手術(shù)為主的綜合治療預(yù)后欠佳[12-13]。因此，學(xué)者們認(rèn)為針對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行治療可能為腫瘤治療開辟新的途徑。既往報(bào)道表明，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44可能對(duì)肺癌生物學(xué)特征以及患者預(yù)后有著重要影響[14]。CD44可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，并參與細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)因子在細(xì)胞表面組裝[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD44在NSCLC組織中過量表達(dá)，且其陽性表達(dá)率越高，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，提示CD44異常表達(dá)與NSCLC發(fā)病有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在 CD44在肺癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且CD44表達(dá)水平與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示 CD44在肺癌中發(fā)揮促瘤作用，其高表達(dá)可能與腫瘤疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)組織中CD44陽性表達(dá)的肺癌患者生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，提示CD44能夠作為NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

miRNA 是由基因組編碼的小分子 RNA，具有組織特異性、保守性和時(shí)序性，在不同的生理和病理進(jìn)程中的miRNA 作用廣泛，這可能與 miRNA 調(diào)控多個(gè)靶基因有關(guān)，miRNA 能通過靶基因結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控功能[17-18]。目前研究表示，某些 miRNA 異常突變或過表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，有約 50% 的 miRNA 基因定位在與腫瘤關(guān)系密切的脆性位點(diǎn)或染色體座位上，其通過直接或者間接作用影響腫瘤的進(jìn)展[19-20]。miRNA通過作用于基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展[21]。近年來的研究表示，眾多miRNA 在肺癌表現(xiàn)異常[22-23]。miR-98-5p 作為miRNA家族的一員，其可靶向結(jié)合α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)而抑制 NSCLC 進(jìn)展[24]；另外，miR-98-5p在肺癌中表達(dá)降低，其可能通過影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進(jìn)而在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[25]。有研究證實(shí)，miR-98-5p 可能作為抑癌因子，在肺癌病變過程中發(fā)揮抑癌作用[26]。本研究中miR-98-5p在肺癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，miR-98-5p相對(duì)表達(dá)量與患者TNM分期、腫瘤分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示 miR-98-5p在肺癌中發(fā)揮抑瘤作用，可能與腫瘤疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。組織中miR-98-5p高表達(dá)的肺癌患者生存率明顯高于低表達(dá)患者，提示miR-98-5p能夠作為肺癌患者預(yù)后的相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述CD44和miR-98-5p表達(dá)水平不僅與肺癌的發(fā)病、臨床病理相關(guān)，還與患者預(yù)后相關(guān)，可能作為患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)發(fā)揮作用，為相關(guān)臨床研究提供新的思路。但本研究樣本量較少，且只對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行研究，導(dǎo)致結(jié)果可能存在一定的局限性，需要在后續(xù)的研究中心加以改進(jìn)和完善。