裴 磊 節(jié)陽(yáng)華 胡 悅 朱 玲 王 寧

胰腺癌(pancreatic cancer)作為最為常見(jiàn)的消化道腫瘤，發(fā)病率連年上升，5年生存率僅9%[1-2]，其高死亡率與不典型的早期癥狀和極易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移有關(guān)。近100年，腫瘤治療在靶向、免疫等方面日新月異，許多患者因此而受益，甚至得到根治，但仍有部分患者因就診晚，缺乏有效的治療方法，治療效果較差。目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者展開(kāi)了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，試圖獲得治療胰腺癌的新診治靶點(diǎn)。橋粒斑菲素蛋白3(Plakophilin 3,PKP3)可以影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞粘附，在腫瘤發(fā)生中起重要作用。PKP3蛋白已被證明在多種癌癥中發(fā)揮作用,如乳腺癌、下咽癌、胃癌、黑色素瘤及其他類型腫瘤，但目前尚無(wú)研究闡述PKP3在胰腺癌中的分布與其生物學(xué)功能。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析PKP3蛋白在不同組織、不同期別胰腺癌組織中的表達(dá)，與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系及其發(fā)揮的生物學(xué)功能，闡述其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 PKP3在胰腺癌中的表達(dá)及其對(duì)生存預(yù)后影響的分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn,GEPIA database)是目前我國(guó)在利用TCGA數(shù)據(jù)做可視化分析上,比較著名的一款在線工具。打開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，在搜索欄中輸入PKP3,在樣本數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇胰腺癌(PAAD),分析PKP3蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織的表達(dá)差異，及其在不同臨床分期胰腺癌組織中的表達(dá)水平。繼續(xù)使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)深層次分析PKP3蛋白與胰腺癌患者的總生存期(overall survival,OS)及無(wú)疾病進(jìn)展生存期(disease free survival,DFS)的關(guān)系。參照PKP3蛋白的表達(dá)水平的中位數(shù),將數(shù)據(jù)庫(kù)中的胰腺癌患者分為高表達(dá)組及低表達(dá)組,對(duì)兩組患者進(jìn)行生存預(yù)后分析。

1.2 觀察PKP3蛋白在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異

The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.proteinatlas.org)是收集各地研究員在實(shí)驗(yàn)室中使用特殊的抗體，用免疫組化染色方法顯示蛋白在不同組織中的表達(dá)圖像，用來(lái)分析某種蛋白在腫瘤組織與癌旁組織表達(dá)的差異。本研究使用該數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖像數(shù)據(jù)，觀察PKP3表達(dá)差異。

1.3 PKP3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及功能分析

應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)與WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)分析與PKP3蛋白關(guān)系緊密的蛋白，記錄排在前10的蛋白，繪制網(wǎng)狀圖及分析它們與PKP3蛋白的相互作用關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證胰腺癌組織和癌旁組織中PKP3的表達(dá)差異;利用F檢驗(yàn)分析不同期別胰腺癌PKP3的表達(dá);采用Kaplan-Meier法計(jì)算PKP3的表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織及不同期別胰腺癌組織中PKP3蛋白的表達(dá)比較

收集GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中的350例標(biāo)本(179例胰腺癌組織標(biāo)本及171例正常胰腺組織標(biāo)本),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法整理分析后發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中PKP3蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),如圖1所示。更深入地分析不同病理期別胰腺癌組織中該基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)病理分期Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌組織中該基因表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.4,P=0.034),如圖2所示。

圖1 PKP3蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況

圖2 不同分期胰腺癌組織中PKP3蛋白表達(dá)比較

2.2 胰腺癌中PKP3 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

利用 GEPIA 數(shù)據(jù)中胰腺癌患者的生存數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析,以PKP3蛋白表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),將數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者分為PKP3 蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組,與低表達(dá)組比較,PKP3蛋白高表達(dá)患者OS明顯縮短(HR=1.4,P=0.034),而DFS比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1,P=0.890),見(jiàn)圖 3、4。

圖3 PKP3蛋白表達(dá)與胰腺癌患者OS的關(guān)系

2.3 胰腺癌組織和正常胰腺組織中PKP3蛋白表達(dá)水平比較

基于The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫(kù)分析胰腺癌

圖4 PKP3 蛋白表達(dá)與胰腺癌患者DFS的關(guān)系

組織和癌旁組織中PKP3 蛋白分布情況。分析得出PKP3蛋白在癌旁組織與胰腺癌組織中均主要定位于囊泡和細(xì)胞膜,染色呈藍(lán)紫色。但在胰腺癌組織中染色明顯較深，如圖5。

2.4 PKP3的生物信息學(xué)分析

在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)與PKP3相關(guān)聯(lián)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)與PKP3在功能及定位上相關(guān)的蛋白,包括DSG1、DSG3、DSG4、DSC1、DSC2、DSC3、DSP、JUP、PPL、DSG2(圖5),利用WebGestalt進(jìn)一步對(duì)這些蛋白分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白主要構(gòu)成細(xì)胞膜、囊泡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。參與多細(xì)胞生物進(jìn)程、細(xì)胞發(fā)展過(guò)程等過(guò)程,發(fā)揮結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合離子等功能。

圖5 PKP3功能及定位相關(guān)蛋白

3 討論

Plakophilins(PKPs)蛋白家族包括PlakoF(PKPl)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，同屬于細(xì)胞黏附分子P120ctn家族，其共同特點(diǎn)為分子結(jié)構(gòu)中具有特征性的Armadillo重復(fù)序列，具體為45個(gè)氨基酸，且與P120ctn該序列的相似50%。PlakophilinsmRNA主要存在于橋粒，對(duì)細(xì)胞橋粒的組成及功能維持有重要作用[3]。PKP3表達(dá)異常引起細(xì)胞黏連的缺失，繼而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處在高活性及高侵潤(rùn)性，使部分腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中分離，實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Aigner[4]與Papagerakis[5]完善實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKP3的低表達(dá)與口腔癌及結(jié)腸癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。Li等[6]認(rèn)為在鼻咽癌組織中，PKP3受miR-149的負(fù)向調(diào)節(jié)，與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。但能否通過(guò)調(diào)整PKP3表達(dá)水平控制腫瘤轉(zhuǎn)移暫無(wú)報(bào)道，仍需后期實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 PKP3存在于細(xì)胞間橋粒組織中,是一種細(xì)胞間黏連蛋白,是細(xì)胞間黏連的主要組織,它與細(xì)胞橋粒的粘附構(gòu)成了細(xì)胞間的連接[7]?，F(xiàn)有研究證實(shí)在不同來(lái)源、不同組織病理學(xué)分期腫瘤組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織之間的PKP3基因的表達(dá)模式存在差異,Papagerakis等[8]發(fā)現(xiàn)在口咽小細(xì)胞癌中,PKP3表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分期呈負(fù)相關(guān)。Schwarz等[9]發(fā)現(xiàn)PKP3基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織,與本研究一致。綜上所述,PKP3基因表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。 本課題研究178例胰腺癌患者總體預(yù)后時(shí)發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)PKP3基因的胰腺癌患者總體生存時(shí)間、無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間明顯縮短。有前期研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、胃癌、宮頸癌患者中，PKP3基因高表達(dá)明顯降低患者生存時(shí)間[10-12]，與本研究一致。說(shuō)明PKP3基因與腫瘤患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。且有研究證實(shí):PKP3的表達(dá)很有可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)[13]。國(guó)外有報(bào)道通過(guò)調(diào)低PKP3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)連接細(xì)胞橋粒體積縮小、細(xì)胞間粘附性下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[14]。而本研究結(jié)論提示高PKP3表達(dá)同樣明顯降低患者生存時(shí)間，推測(cè)原因可能因?yàn)椋涸谀[瘤外因驅(qū)使下，細(xì)胞粘附蛋白排列紊亂，細(xì)胞橋粒體積過(guò)小，兩者喪失粘附作用，導(dǎo)致腫瘤局部進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。通過(guò)String及WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PKP3及相關(guān)蛋白分析顯示,與PKP3蛋白相關(guān)的功能蛋白主要位于細(xì)胞膜、囊泡等膜性結(jié)構(gòu)中,參與多細(xì)胞生物進(jìn)程、細(xì)胞發(fā)展過(guò)程等過(guò)程,在結(jié)合蛋白、離子等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但其具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

以往的實(shí)驗(yàn)研究方法一次僅能研究少數(shù)或幾個(gè)基因,但隨著測(cè)序技術(shù)的不斷的改進(jìn)和升級(jí)及基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的大規(guī)模應(yīng)用,產(chǎn)出的研究成果翻了幾倍。如今的公共數(shù)據(jù)庫(kù)整合了多項(xiàng)研究成果,利用當(dāng)前的生物信息分析技術(shù)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的海量信息進(jìn)行整合分析,更有利于從多個(gè)角度探索某個(gè)或某些基因與疾病的內(nèi)在聯(lián)系,為更深層次了解疾病打下基礎(chǔ)。使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步分析，后期結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證及擴(kuò)展，已成為現(xiàn)如今科研新方向。

PKP3蛋白存在于生物體內(nèi)幾乎所有器官中，在不同腫瘤組織中表達(dá)水平各不相同，但其表達(dá)差異引起細(xì)胞間黏性改變，繼而引起腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)多個(gè)生物數(shù)據(jù)庫(kù)得出結(jié)論：在胰腺癌組織中PKP3蛋白呈高表達(dá),其表達(dá)水平與患者不良預(yù)后呈正相關(guān),PKP3蛋白參與多種生物學(xué)過(guò)程,有希望成為胰腺癌診斷和治療的新靶點(diǎn),但其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究。