邢瑩，余姝婷，朱小利

（南通市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226000）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma, EC）是一種發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，多發(fā)于圍絕經(jīng)期與絕經(jīng)后的女性，致死率僅次于宮頸癌和卵巢癌[1]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）屬于非編碼RNA，其長度＞200 個核苷酸，同其他非編碼RNA 一樣， lncRNA 也不能編碼蛋白質(zhì)[2]。LncRNA 在機體病理、生理過程中扮演著重要角色，有研究[3-4]顯示，lncRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。LncRNA XIST 是染色體Xq13.2 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，存在于X 染色體中心的無活性區(qū)域，與X 染色體的相關(guān)基因激活有關(guān)[5]。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，lncRNA XIST 參與乳腺癌、肝癌、肺癌等多種類型腫瘤的發(fā)展。MicroRNA 也屬于非編碼 RNA 的一種， 其中 microRNA-101-3p（miR-101-3p）屬于miR-101 家族成員，在乳腺癌細胞的侵襲、遷移中有重要作用[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p 可以靶向調(diào)控EZH2 誘導(dǎo)EC 細胞發(fā)生自噬。此外，lncRNA XIST 還可以通過調(diào)節(jié)miR-101-3p 影響乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖、遷移[9]。本研究旨在探究lncRNA XIST 在EC 組織中的表達及其靶向miR-101-3p 對癌細胞生物行為學(xué)的影響，以期為EC 的治療靶點提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取 2019 年 7 月—2021 年 7 月南通市婦幼保健院收治的82 例手術(shù)切除且經(jīng)術(shù)后病理確診的子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織與癌旁正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本（與手術(shù)切緣的距離＞3 cm）。患者術(shù)前均未接受過化療與放療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 材料

1.2.1 細胞系 人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa、HEC-1A、RL-952 與正常人子宮內(nèi)膜細胞系購自江西南昌綜合細胞庫。

1.2.2 儀器與試劑 HBS-ScanY 全波長酶標(biāo)分析儀購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司，BX43 生物學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，Hifair?ⅢOne Step RT-qPCR SYBR Green Kit（貨號：11143ES50）購自上海翌圣生物科技股份有限公司，CCK-8 試劑盒（貨號：EM1859）購自武漢菲恩生物科技有限公司，LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑（貨號：L3000015）購自江西贛宣科儀生物有限公司，Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 雙熒光素酶試劑盒（貨號：HY-K-1013）購自美國MCE 公司，Transwell 小室（貨號：3472）購自美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織lncRNA XIST 和miR-101-3p mRNA 相對表達量檢測 采用TRIzol法提取子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織總RNA。采用一步法試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，并進行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：模板RNA+上游引物+下游引物+無菌水+2×Hifair?Ⅲ S G Buffer+ Hifair?U H Ⅲ E nzymes+Hifair?50×High Rox，反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄10 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃擴增反應(yīng)10 s，60℃擴增反應(yīng)30 s，共 4 0 次 循 環(huán) 。 L ncRNA XIST 正 向 引 物 ： 5'-GTAACATAGACCATGAC-3'，反 向 引 物 ： 5'-TACCTAGACATTGACAT-3'， 引 物 長 度 102 bp；miR-101-3p正向引物：5'-CCGATACATAGGACAA-3'，反向引物：5'-TGGACATTTGACCAT-3'，引物長度81 bp；以U6作為內(nèi)參基因，根據(jù) 2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3.2 細胞系lncRNA XIST 相對表達量檢測 常規(guī)復(fù)蘇處理 I shikawa、HEC-1A、RL-952 與正常人子宮內(nèi)膜細胞后傳代培養(yǎng)，采用TRIzol 法提取總RNA。采用一步法試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，并進行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：模板RNA+上游引物+下游引物+無菌水+2×Hifair?Ⅲ S G Buffer+ Hifair?U H Ⅲ E nzymes+Hifair?50×High Rox，反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄10 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃擴增反應(yīng)10 s，60℃擴增反應(yīng)30 s，共40 次循環(huán)。LncRNA XIST 引物序列正向引物：5'-GTAACATAGACCATGAC-3'，反向引物：5'-TACCTAGACATTGACAT-3'， 引 物 長 度 1 02 bp，以U6作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3.3 細胞培養(yǎng)分組及轉(zhuǎn)染 根據(jù)1.3.2 中結(jié)果，選取lncRNA XIST mRNA 相對表達量高的人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa 進行后續(xù)實驗。待Ishikawa 細胞生長至對數(shù)生長期時，接種于6 孔板，接種密度為2×106個/孔。簡單隨機分為對照組（C 組）、空質(zhì)粒組（NC 組）、lncRNA XIST 表達抑制組（sh-XIST 組），其中NC 組和sh-XIST 組分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒與plkolncRNA XIST-shRNA，C 組不進行任何處理。轉(zhuǎn)染后細胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃、濕度60%、5%CO2）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，轉(zhuǎn)染率≥80%即視為轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染率=傳染成功細胞總數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.4 CCK-8 法檢測各組Ishikawa 細胞增殖活性 收集1.3.2 中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細胞接種在96 孔板中，接種密度為1×105個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12 h、24 h、48 h 時向各孔滴加 1 0μL CCK-8 溶液，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，放置二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測各組細胞在450 nm 波長處的光密度（OD）值，根據(jù)OD 值繪制細胞活性曲線。

1.3.5 劃痕實驗檢測各組Ishikawa 細胞遷移能力 收集1.3.2 中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細胞接種于6 孔板中，接種密度為2×105個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用10 μL移液槍槍頭垂直6 孔板表面做連續(xù)直線型劃痕，用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基洗去因劃痕操作而脫落的細胞，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別記錄初始劃痕的寬度（T0）和24 h 的劃痕寬度（T24），計算劃痕愈合率以代表細胞的遷移能力。劃痕遷移率=（T0-T24）/T0×100%。

1.3.6 Transwell 小室實驗檢測各組Ishikawa 細胞侵襲能力 取1.3.2 中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細胞，棄去培養(yǎng)基換成無血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，再將細胞吹打重懸并計數(shù)。取出事先準(zhǔn)備好的Transwell小室（已用Matrigel 膠預(yù)鋪在小室的上室面），在上室中每孔加入200 μL（含有1×105個細胞）的重懸細胞液，培養(yǎng)板中每孔加入600 μL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS 清洗小室，用棉拭子將上室面未穿膜的細胞除去，用0.1%的結(jié)晶紫染色后用PBS 沖洗干凈，置于顯微鏡下觀察細胞穿膜情況并計數(shù)。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因驗證lncRNA XIST 與miR-101-3p 的靶向性 Target Scan 數(shù)據(jù)庫顯示lncRNA XIST 與miR-101-3p 核苷酸存在結(jié)合位點，根據(jù) l ncRNA XIST 與 m iR-101-3p-3'-UTR 結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果，用Lipofectamine TM 3000 將野生型miR-101-3p 質(zhì) 粒 （miR-101-3p-WT）與 突 變 型 miR-101-3p 質(zhì)粒（miR-101-3p-MT）分別與 l ncRNA XIST-mimics、lncRNA XIST-mimics-NC 共 轉(zhuǎn) 染 于 Ishikawa 細胞，分別為lncRNA XIST-mimics-miR-101-3p-WT 組 、 lncRNA XIST-mimics-miR-101-3p-MT 組 、 lncRNA XIST-mimics-NC-miR-101-3p-WT組 、 lncRNA XIST-mimics-NC-miR-101-3p-MT 組 。 轉(zhuǎn)染后24 h，用PBS 洗滌細胞，并加入250 μL RIPA 裂解液，待充分裂解后采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光強度A 與B，以A/B 來表示熒光素酶的相對活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較用方差分析，兩組比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織lncRNA XIST 和miR-101-3p mRNA相對表達量的比較

子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織lncRNA XIST mRNA 相對表達量分別為（1.87±0.20）和（0.91±0.11），經(jīng)t檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.817，P=0.048），子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA XIST mRNA 相對表達量高于癌旁組織。子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織的miR-101-3p mRNA 相對表達量分別為（0.21±0.06）和（0.58±0.19），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.216，P=0.032），子宮內(nèi)膜癌組織miR-101-3p mRNA 相對表達量低于癌旁組織。

2.2 不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA XIST、miR-101-3p mRNA 相對表達量的比較

不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA XIST、miR-101-3p mRNA 相對表達量的比較見表1、2。不同TNM 分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移患者的lncRNA XIST、miR-101-3p mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA XIST mRNA相對表達量的比較 （）

表1 不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織lncRNA XIST mRNA相對表達量的比較 （）

n t/F 值lncRNA XIST mRNA P 值69 13 1.71±0.28 1.67±0.130.6910.493images/BZ_33_1284_789_1511_854.png臨床病理特征年齡≥50歲＜50歲Ⅰ、Ⅱimages/BZ_33_1511_789_1954_854.pngimages/BZ_33_1954_789_2089_854.pngⅢ Ⅳ66 12 3 1.54±0.21 1.70±0.17 1.77±0.16 4.6020.013images/BZ_33_1284_1049_1511_1114.pngimages/BZ_33_1511_1049_1954_1114.png≥2 cm＜2 cmimages/BZ_33_1954_1049_2089_1114.png24 58 1.69±0.20 1.72±0.120.8380.405images/BZ_33_1284_1244_1511_1309.pngimages/BZ_33_1511_1244_1954_1309.pngimages/BZ_33_1954_1244_2089_1309.png是 否11 71 1.73±0.25 1.61±0.112.7300.008

2.3 不同子宮內(nèi)膜癌細胞系中l(wèi)ncRNA XIST mRNA相對表達量的比較

人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa、HEC-1A、RL-952及正常人子宮內(nèi)膜細胞系的lncRNA XIST mRNA 相對表達量分別為（2.02±0.11）、（1.21±0.10）、（1.32±0.23）和（0.19±0.04），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=89.091，P=0.000）；人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa 的lncRNA XIST mRNA 相對表達量高于其他各細胞系（P＜0.05）。

2.4 NC組與sh-XIST組細胞轉(zhuǎn)染成功

NC 組與sh-XIST 組細胞轉(zhuǎn)染率均≥80%，轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 兩組轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞熒光圖 （×50）

2.5 各組Ishikawa細胞增殖活性的比較

C 組、NC 組、sh-XIST 組不同時間點 Ishikawa細胞增殖活性比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的細胞增殖活性有差異（F=6.182，P=0.002）；②C 組、NC 組、sh-XIST 組的細胞增殖活性有差異（F=5.071，P=0.001），sh-XIST 組與C 組和NC 組比較，細胞增殖活性均較低 （P＜0.05）；③C 組、NC 組、sh-XIST 組的細胞增殖活性變化趨勢有差異（F=3.174，P=0.000）。見表3 和圖2。

圖2 各組細胞不同時間點的細胞增殖活性

表2 不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織miR-101-3p mRNA相對表達量的比較 （）

表2 不同臨床病理特征患者子宮內(nèi)膜癌組織miR-101-3p mRNA相對表達量的比較 （）

images/BZ_33_1284_1663_1511_1798.png≥45歲＜45歲Ⅰ、Ⅱimages/BZ_33_1511_1663_1609_1734.png images/BZ_33_1609_1663_2097_1734.png P 值images/BZ_33_1511_1734_1942_1798.pngimages/BZ_33_1942_1734_2097_1798.png45 37 0.50±0.11 0.51±0.141.1740.132images/BZ_33_1284_1928_1511_1993.pngimages/BZ_33_1511_1928_1942_1993.pngimages/BZ_33_1942_1928_2097_1993.pngⅢ Ⅳ66 12 3 0.58±0.15 0.48±0.13 0.41±0.10 3.9880.022images/BZ_33_1284_2188_1511_2253.pngimages/BZ_33_1511_2188_1942_2253.png≥2 cm＜2 cmimages/BZ_33_1942_2188_2097_2253.png24 58 0.51±0.19 0.53±0.150.5070.614images/BZ_33_1284_2383_1511_2448.pngimages/BZ_33_1511_2383_1942_2448.pngimages/BZ_33_1942_2383_2097_2448.png是 否11 71 0.43±0.11 0.57±0.143.7840.000

表3 不同時間點各組Ishikawa細胞增殖活性的比較（）

表3 不同時間點各組Ishikawa細胞增殖活性的比較（）

注 ：①與C組比較，P ＜0.05；②與NC組比較，P ＜0.05。

組別C組NC組sh-XIST組12 h 0.55±0.05 0.52±0.06 0.41±0.05①②24 h 1.17±0.11 1.13±0.09 0.68±0.07①②48 h 1.41±0.15 1.45±0.14 0.81±0.10①②

2.6 各組Ishikawa細胞遷移能力的比較

C 組 、 NC 組 、 sh-XIST 組 Ishikawa 細 胞 24 h 的劃痕遷移率分別為（58.17±1.15）%、（54.51±1.82）%、（23.11±1.07）%，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=578.366，P=0.000），sh-XIST 組低于 C 組和 NC 組 （P＜0.05）。見圖 3。

圖3 各組shikawa細胞遷移能力 （×20）

2.7 各組Ishikawa細胞侵襲能力的比較

C 組 、NC 組 、sh-XIST 組 的 入 侵 細 胞 分 別 為（637.50±60.10）個 、（602.30±61.50）個 、（187.20±33.10）個，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=66.488，P=0.000），sh-XIST 組少于 C 組和NC 組 （P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組Ishikawa細胞侵襲能力 （×40）

2.8 雙熒光素酶活性檢測lncRNA XIST 與miR-101-3p的靶向性

Targetscan（http：//www.targetscan.org/）網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA XIST 與miR-101-3p 基因序列存在結(jié)合位點，見圖5。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示 ，lncRNA XIST-mimics-NC-miR-101-3p-WT 組 、lncRNA XIST-mimics-miR-101-3p-WT 組 、lncRNA XIST-mimics-NC-miR-101-3p-MT 組、lncRNA XIST-mimics-miR-101-3p-MT 組的熒光素酶活性分別為（1.17±0.21）、（0.48±0.11）、（1.22±0.13）、（1.15±0.12），各組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.919，P=0.001），mimics-NC組miR-101-3p-WT高 于 mimics-miR-101-3p 組 miR-101-3p-WT（P＜0.05）。見圖6。

圖5 lncRNA XIST的靶基因預(yù)測

圖6 各組熒光素酶相對活性比較

3 討論

EC 是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)于絕經(jīng)后女性，但近年來隨著人們生活方式的不斷改變，EC 的發(fā)病群體逐漸年輕化，發(fā)病率也逐年上升[10]。由于EC 的高發(fā)病率與致死率，導(dǎo)致女性生命健康受到極大威脅。雖然治療EC 醫(yī)療技術(shù)在不斷提高，但EC 患者的生存率和復(fù)發(fā)率仍然困擾著患者和醫(yī)生。因此，探尋EC 的發(fā)生機制對EC 的治療具有至關(guān)重要的作用。非編碼RNA 分為lncRNA、miRNA、干擾小 RNA 等，其中 lncRNA 長度一般＞200 個核苷酸，且被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)展具有密切關(guān)系[11]。lncRNA XIST 是有關(guān)X 染色體失活的轉(zhuǎn)錄本，可以特異性地與X 染色體結(jié)合并參與介導(dǎo)其失活。MicroRNA 的長度一般為22 個核苷酸，在真核細胞的基因表達調(diào)控中具有重要作用。miR-101-3p 被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤有關(guān)，并且可以作為前列腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[12]。

本研究結(jié)果顯示，EC 組織中 lncRNA XIST mRNA 相對表達量高于癌旁組織，miR-101-3p表達量低于癌旁組織，且在不同TNM 分期和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者EC 組織中的表達有差異。TNM 分期越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC 組織中l(wèi)ncRNA XIST 表達 越 高 、 miR-101-3p 越 低 。 說 明 EC 組 織 中l(wèi)ncRNA XIST 的表達被激活，miR-101-3p 的表達被抑制，這兩種非編碼RNA 與腫瘤的臨床病理特征密切相關(guān)。既往研究[13]顯示，miR-101-3p 在腎細胞癌細胞系中的表達受到抑制，過表達miR-101-3p可以抑制腎細胞癌細胞系的增殖、遷移與侵襲。張鈺等[14]的研究顯示，lncRNA XIST 在膀胱癌患者血清中表達升高，且其表達量與TNM 分期與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。楊紫偉等[15]專利中顯示，lncRNA XIST 可以作為胃癌診斷的標(biāo)志物，可以作為治療胃癌的靶點。以上研究與本研究結(jié)果共同說明，lncRNA XIST 與miR-101-3p 與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可以作為某些癌癥的診斷標(biāo)志物。

本研究通過CCK-8 法、劃痕實驗、Transwell 小室實驗發(fā)現(xiàn)sh-XIST 組細胞的細胞增殖活性、遷移能力與侵襲能力均低于C 組和NC 組。提示沉默lncRNA XIST 可以抑制Ishikawa 細胞的惡性生物行為。閔捷等[16]研究顯示，lncRNA XIST 在胰腺癌中表達量高于癌旁組織，并且沉默胰腺癌細胞中l(wèi)ncRNA XIST 后胰腺癌細胞的增殖與遷移能力降低。這與本研究結(jié)果共同說明，沉默lncRNA XIST 可以抑制癌細胞的惡性生物學(xué)行為。此外，本研究中雙熒光素酶報告基因顯示，lncRNA XIST 可以靶向作 用 于 miR-101-3p， 說 明 在 Ishikawa 細 胞 中l(wèi)ncRNA XIST 可以靶向調(diào)節(jié) miR-101-3p。DU 等[17]研究顯示，在甲狀腺乳頭狀癌細胞中，lncRNA XIST可以靶向作用于miR-101-3p，對癌細胞的遷移與侵襲進行調(diào)控。這與本研究結(jié)果共同說明，lncRNA XIST 確可以靶向調(diào)節(jié)miR-101-3p。

綜上所述，lncRNA XIST 和miR-101-3p 在人子宮內(nèi)膜癌組織中異常高表達，Ishikawa 細胞中的lncRNA XIST 可以靶向調(diào)控miR-101-3p 影響細胞生物學(xué)行為。但本研究選取的臨床標(biāo)本數(shù)量有限，結(jié)果可能存在偏倚，因此還需后續(xù)擴大樣本量進行驗證。