郭祖霆 朱 陽 曹慧敏 李 雙 周 旭 遲長鳳 苗增良

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘利用國家地方聯(lián)合工程研究中心 浙江舟山 316022)

神經(jīng)肽泛指一類由神經(jīng)內(nèi)分泌組織分泌的小分子多肽, 廣泛參與生物體的神經(jīng)調(diào)節(jié)、生長、發(fā)育、生殖等多種生理活動(徐衛(wèi)華, 1997)。目前已知的最大的神經(jīng)肽家族FMRFamide 相關(guān)肽(FLP)在很多門類的物種中都有表達(Priceet al, 1977a; Muthalet al,1994; Espinozaet al, 2000; Kodaet al, 2002; Nichols,2003; Grimmelikhuijzenet al, 2004)。FLP 家族中以首次從光芒長文蛤(Macrocallista nimbosa)的神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的四肽FMRFamide 為代表(Priceet al, 1977b)。生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其廣泛參與多種生理過程, 包括攝食、心跳、滲透平衡(Salzetet al, 1994; Dockray, 2004)、變態(tài)、防御(Andersonet al, 2004)、免疫(Liet al, 2019)及繁殖、運動(Coateset al, 2002; Keatinget al, 2003)等。神經(jīng)肽通過其相應(yīng)受體激活不同的信號通路介導(dǎo)不同的功能作用。作為神經(jīng)遞質(zhì), FMRFamide通過受體的介導(dǎo)激活腺苷酸環(huán)化酶, 并以cAMP 為第二信使激活下游通路, 發(fā)揮相應(yīng)的功能活性(Tensenet al, 1998)。

虎斑烏賊(Sepia pharaonis)是我國南海海域重要的經(jīng)濟頭足類之一(陳道海等, 2013), 具有個體大、味道鮮美、餌料轉(zhuǎn)換率高、抗病強、生長速度快等優(yōu)良品質(zhì)。然而, 由于人類的過度捕撈和海域環(huán)境的變化,20 世紀80 年代以來虎斑烏賊的漁業(yè)資源日益縮減(勵一鳴, 1989)。目前, 已攻克虎斑烏賊育苗和養(yǎng)殖技術(shù)。但是, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷推廣, 在其養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)性早熟問題, 針對此開展其生殖調(diào)控機理研究勢在必行。

頭足類的某些物種, 如萊氏擬烏賊(Sepioteuthislessoniana) (Ikedaet al, 2009) 、 商 烏 賊(Sepia officinalis) (Domingueset al, 2002)、大西洋魷魚(Illex illecebrosus) (Daweet al, 2000)和藍蛸(Octopus cyanea) (Heukelem, 1973)等性腺發(fā)育調(diào)控機制研究表明, 神經(jīng)肽對頭足類的生殖調(diào)控起重要作用(Onitsukaet al, 2009; Caoet al, 2016)。本文通過同源克隆及RACE (rapid amplification of cDNA end)技術(shù)克隆虎斑烏賊 FMRFamide G 蛋白偶聯(lián)受體基因(SpFaGPCR)的cDNA 全長序列, 并進行生物信息學(xué)分析; 利用實時熒光定量(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)檢測SpFaGPCR在雌性個體中的組織表達模式; 進一步采用原位雜交(in situhybridization,ISH)技術(shù)定位分析SpFaGPCR在不同生殖調(diào)控相關(guān)組織中的分布特征。實驗結(jié)果將為認識SpFaGPCR 的功能特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 對于進一步深入探究FMRFamide 通過SpFaGPCR 參與生殖調(diào)控的生理代謝過程具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用的野生虎斑烏賊[體重: (81.13±16.6) g,胴長: (8.25±0.9) cm]購自廣東省湛江市硇洲島漁民。經(jīng)乙醇麻醉后活體解剖, 取出視葉、腦、視網(wǎng)膜、副纏卵腺、纏卵腺等組織于RNA保存液中, 4 °C過夜后轉(zhuǎn)入–80 °C冰箱保存?zhèn)溆? 另一部分固定于4%多聚甲醛4 °C過夜。

1.2 全長cDNA 的克隆

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 Trizol法提取總RNA, 具體方法參照Zheng等(2021)。1.2% 瓊脂糖及核酸分析儀(Eppendorf)分別檢測總RNA的完整性、純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA根據(jù)試劑盒(TaKaRa, Japan)說明書進行, 保存于–20 °C備用。

1.2.2S p F a G P C R全 長c D N A 的 克 隆 根 據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書利用1.0 μg腦組織總RNA制備3′端和5′端RACE模板。設(shè)計虎斑烏賊F a G P C R基因的簡并引物SpFaGPCR-F/R (表1)擴增、測序保守區(qū)序列。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計5′/3′端特異性RACE引物5′/3′-SpFaGPCRoutter/inner (Tm＞70 °C) (表1)分別進行兩端未知序列的擴增。第一輪擴增的反應(yīng)體系為: Ex Taq Mix 25 μL, 3′/5′-RACE模板 2.0 μL, 5′/3′-SpFaGPCR-outter 1.0 μL, 5′/3′-RACE Adapter 1.0 μL, RNase-free ddH2O 21 μL; 反應(yīng)程序為94 °C 30 s, 72 °C 3 min, 5個循環(huán); 94 °C 30 s, 70 °C 30 s, 72 °C 3 min, 5個循環(huán);94 °C 30 s, 68 °C 30 s, 72 °C 3 min, 25個循環(huán); 以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪巢式PCR, 反應(yīng)體系和程序參照第一輪。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、凝膠回收、連接轉(zhuǎn)化后, 挑陽性單克隆送至上海生工進行測序拼接后獲得SpFaGPCR的cDNA全長序列。

表1 引物信息Tab.1 Information of the primers

1.3 序列生物信息學(xué)分析

序列的同源比對、多序列比對和修飾、開放閱讀框(ORF)的查找、氨基酸序列的預(yù)測、信號肽、蛋白的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測、進化樹的構(gòu)建參考朱陽(2020)。

1.4 組織表達差異性

采用 qRT-PCR 檢測性成熟時期雌性個體SpFaGPCR的組織分布特點。按照試劑盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)]說明書 操 作。 反 應(yīng) 體 系 為: TB Green 12.5 μL、qSpFaGPCR-F/R 1.0 μL、cDNA 2.0 μL、RNase-free ddH2O 8.5 μL; 反應(yīng)程序為: 95 °C 30 s; 95 °C 5 s,60 °C 45 s, 40 次循環(huán)。每個組織3 個生物學(xué)重復(fù),每個樣品3 個平行。內(nèi)參基因選用虎斑烏賊β-actin基因和GAPDH基因(見表1)。

采用2–ΔΔCt方法進行雙內(nèi)參計算和統(tǒng)計, 采用SPSS 18.0 進行單因素方差分析分析(One-way ANOVA)和顯著性差異分析(Duncan 法),P＜0.05 為顯著差異;繪圖采用GraphPad 軟件。

1.5 原位組織分布

1.5.1 組織切片 固定過夜的各組織PBS清洗后,經(jīng)梯度甲醇(25%, 50%, 75%, 100%)逐級脫水2×45 min/次, 二甲苯透明2×45 min/次, 繼而透蠟3×1 h/次后包埋, 切片7 μm, 保存于–20 °C備用。

1.5.2 探針制備 原位雜交探針的引物A-SpFaGPCRF/R、S-SpFaGPCR-F/R見表1。反義探針在F引物前加上啟動子序列(GATCACTAATACGACTCACTATAGG),正義探針在R引物前加上啟動子序列。以腦組織cDNA為模板, 擴增反應(yīng)及程序見表1。PCR產(chǎn)物作為模板利用DIG RNA Labeling Mix制備探針, 方法同朱陽(2020)。探針經(jīng)純化、質(zhì)量和濃度檢測后于–80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 原位雜交 具體的方法步驟參照Zheng等(2020), 保存的組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟處理, 100%-90%-80%-70%-30%的乙醇梯度復(fù)水, 蛋白酶K 37 °C消化8 min, Tris/甘氨酸終止消化反應(yīng)。4%多聚甲醛再固定, 4×SSC孵育組織切片后滴加預(yù)雜交液(去離子甲酰胺500 μL, 20×SSC 250 μL, 50×Denhard’s solution 100 μL, 鮭魚精子單鏈DNA 10 μL, RNasefree ddH2O 140 μL) 42 °C預(yù)雜交2 h。預(yù)雜交結(jié)束后,替換為預(yù)先80 °C變性5 min的雜交液(去離子甲酰胺500 μL, 20×SSC 250 μL, 50×Denhard’s solution 100 μL,鮭魚精子單鏈DNA 10 μL, RNase-free ddH2O 90 μL,1 g/mL硫酸葡聚糖50 μL, 探針3 ng/μL)置于50 °C的恒溫培養(yǎng)箱中孵育12～16 h。

1.5.4 Anti-DIG抗體孵育 第二天雜交結(jié)束后,組織切片用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC梯度清洗2次, 每級15 min。將配置好的封閉液(1 mL PBS中各加20 μL山羊血清、20 μL 100 mg/mL BSA)滴加到組織片上室溫封閉2～3 h, 抗體(1 : 1 000) 4 °C孵育過夜。TBST清洗若干次后, 采用NBT/BCIP進行顯色反應(yīng), 半小時更換一次顯色液。顯色完成后, 封片、拍照。

2 結(jié)果

2.1 cDNA 全長序列分析

將簡并引物擴增序列與3′-RACE、5′-RACE 擴增序列進行拼接, 獲得SpFaGPCR的cDNA 全長序列(圖1), 共1 514 bp, 包含一個222 bp 的5′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR), 35 bp 的3′-UTR, 1 257 bp的開放閱讀框(opening reading frame, ORF), 編碼一個418 個氨基酸殘基組成的多肽。預(yù)測的多肽對分子量(MW)為49.8 kDa, 理論等電點(pI)為9.76。SignalP預(yù)測推導(dǎo)的SpFaGPCR 的N 端沒有信號肽; SMART結(jié)構(gòu)域分析顯示SpFaGPCR 有7 個跨膜域, 預(yù)測有7個糖基化位點、36 個磷酸化位點; 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析SpFaGPCR 有α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

圖1 SpFaGPCR 的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SpFaGPCR

2.2 同源序列比對

如圖2 所示,SpFaGPCR 氨基酸序列與頭足類動物曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)、雙斑蛸(Octopus bimaculoides)和雙殼類動物美洲牡蠣(Crassostreavirginica)和長牡蠣(Crassostrea gigas)序列具有高度相似性, 相似性分別為98%、82%、65%和62%。

用 ClustalW 對SpFaGPCR 以及其他代表物種FaGPCR 的氨基酸序列進行分析(圖2),SpFaGPCR 分別具有三個胞內(nèi)環(huán)(Intracellular Loop, IL)和三個胞外環(huán)(Extracellular Loop, EL), 其中跨膜區(qū)(Transmembrane,TM)的序列更加保守。

圖2 SpFaGPCR (用▼表示)與其他代表物種FaGPCR 的多序列比對Fig.2 Multiple alignment of representative species FaGPCR and SpFaGPCR (noted by▼)

SpFaGPCR 與代表物種FaGPCR 的最大似然法(Bootstrap 10000)系統(tǒng)進化分析(圖3)顯示: 虎斑烏賊與曼氏無針烏賊FaGPCR 等頭足類首先聚為一支, 再與雙殼綱動物聚為姐妹支, 異盤并殖吸蟲(Paragonimus heterotremus) FaGPCR 作為外群。因此,系統(tǒng)進化分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類結(jié)果高度一致。

圖3 SpFaGPCR (用▼表示)與其他12 種代表物種FaGPCR 構(gòu)建的最大似然法進化樹Fig.3 SpFaGPCR (noted by ▼) and FaGPCRs of other 12 representative species are used to construct a phylogenetic tree based on the maximum likelihood method

2.3 組織表達差異性

選取成熟雌性虎斑烏賊十五種組織檢測SpFaGPCR的組織分布表達, 以表達量最低的卵巢為參照(設(shè)定為1), 結(jié)果如圖4 所示。實驗結(jié)果表明,SpFaGPCR在虎斑烏賊雌性的多種組織中均有表達。SpFaGPCR在腦、視葉、視腺和纏卵腺中的表達顯著高于其他組織(P＜0.05), 并且其在視葉的表達量最高(P＜0.05)。而SpFaGPCR在其他組織的表達無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 SpFaGPCR 基因在虎斑烏賊不同組織中的表達Fig.4 The expression level of SpFaGPCR gene in different tissues

2.4 原位組織分布

如圖5 所示, 在視葉組織中, HE 染色可以清晰觀察到從外到內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)依次為深層視網(wǎng)膜外細胞顆粒層、網(wǎng)質(zhì)層、深層視網(wǎng)膜內(nèi)細胞顆粒層、邊緣髓質(zhì)區(qū)、中央髓質(zhì)區(qū)(圖5-1)。原位雜交結(jié)果表明, 與正義探針相比(圖5-2), 在中央髓質(zhì)區(qū)域有SpFaGPCR的強烈陽性雜交信號, 邊緣髓質(zhì)區(qū)域的陽性信號較弱; 視葉皮層未檢測到信號(圖5-3, 4)。

圖5 視葉組織的HE 染色及SpFaGPCR 基因mRNA 的原位組織定位Fig.5 HE staining and localization of SpFaGPCR mRNA in the optic lobe

在視網(wǎng)膜組織中(圖6), HE 染色可以清晰觀察到感光細胞層、支持細胞層、上皮細胞層(圖6-1)。與正義探針相比(圖6-2, 4), 反義探針孵育后的視網(wǎng)膜只在視網(wǎng)膜感光細胞的感光層中被觀察到了強烈的SpFaGPCRmRNA 陽性雜交信號(圖6-3, 5)。

如圖 7 所示: 與正義探針的無雜交信號對比(圖 7-2), 反義探針孵育后的纏卵腺葉瓣上有很明顯的陽性雜交信號, 且雜交信號分布在葉瓣的外側(cè), 即纖毛生長的部位(圖7-3, 4)。

圖7 纏卵腺組織的HE 染色及SpFaGPCR mRNA 的原位組織定位Fig.7 HE staining and SpFaGPCR mRNA localization in the nidamental gland

3 討論

GPCR 作為機體內(nèi)非常重要的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族之一, 廣泛參與調(diào)控細胞對光照、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等的應(yīng)答, 對調(diào)節(jié)生物體正常的生理代謝具有非常重要的意義(周慶同等, 2021)。神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、神經(jīng)激素在機體內(nèi)調(diào)控作用的發(fā)揮均需要通過靶細胞膜上受體的介導(dǎo)將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)。GPCR 是其中的一大類受體家族, 屬于視紫質(zhì)受體家族, 具有明顯的七跨膜結(jié)構(gòu)域。

本研究利用同源克隆和RACE 技術(shù), 獲得了虎斑烏賊FMRFamide 的G 蛋白偶聯(lián)受體(SpFaGPCR)基因的cDNA 全長, 生物信息分析其有7 個跨膜區(qū); 多序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與目前在頭足類中發(fā)現(xiàn)的FaGPCR 高度相似; 系統(tǒng)進化分析顯示SpFaGPCR 與頭足綱、雙殼綱等軟體動物FaGPCR 聚為姐妹支, 多角度證實了本研究克隆獲得的SpFaGPCR屬于FMRFamide 的GPCR。預(yù)測SpFaGPCR有多個糖基化和磷酸化位點, 這可能有利于胞外部分糖基化和配體的結(jié)合及胞內(nèi)磷酸化介導(dǎo)的脫敏作用和細胞內(nèi)吞作用(Mertenset al, 2006)。實時熒光定量結(jié)果顯示,SpFaGPCR在雌性個體的表達有顯著差異, 主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中表達, 這與FLP 是一種神經(jīng)活性肽主要發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控作用相關(guān)。SpFaGPCR在纏卵腺中有較高的表達量, 推測其可能參與到虎斑烏賊排卵等生殖活動中; 其次,SpFaGPCR在雌性個體的心臟、肌肉、腸道、胃等收縮性能較強的組織中也有一定的表達量, 可能與已發(fā)現(xiàn)的FMRFamide 調(diào)控肌肉運動功能相關(guān), 這一結(jié)果與FMRFamide 高豐度表達于長牡蠣外套膜參與肌肉收縮相一致(Liet al, 2019)。GPCR 被FLP 激活后可激活或抑制一種特異酶(如cAMP、cGMP 等), 并作為第二信使激活蛋白激酶, 蛋白激酶進而又激活磷酸激酶, 將ATP 轉(zhuǎn)換為ADP 來介導(dǎo)相關(guān)反應(yīng); 另外, 被活化的GPCR 也可以激活一些離子通道如Ga2+通道等, 引起膜電位的改變, 從而調(diào)節(jié)生物體的生理活動。Chin 等(1994)報道發(fā)現(xiàn)FMRFamide 受體對不同F(xiàn)MRFamide 多肽的結(jié)合能力不同, 并且發(fā)現(xiàn)FMRFamide 受體在接受FMRFamide 類多肽結(jié)合激活時, GTP 是必不可少的。推測, FMRFamide 在細胞膜上與跨膜的FaGPCR 結(jié)合, 參與介導(dǎo)各項生理活動的調(diào)控作用。

在解剖學(xué)上, 頭足類的視葉由深層視網(wǎng)膜和髓質(zhì)區(qū)兩部分構(gòu)成。其中, 深層視網(wǎng)膜由內(nèi)顆粒細胞層、網(wǎng)織區(qū)和外顆粒細胞層組成, 其中, 網(wǎng)織區(qū)由四層放射狀神經(jīng)纖維組成(Moore, 1919; Newth, 1972)。研究表明, 頭足類的深層視網(wǎng)膜構(gòu)成其視覺分析系統(tǒng), 而髓質(zhì)是神經(jīng)中樞(CNS)與運動和記憶相關(guān)的區(qū)域(Moore, 1919)。視神經(jīng)將視網(wǎng)膜與視葉直接相連(Wells, 1978), 但目前對于視葉和視網(wǎng)膜兩者在視神經(jīng)活動中所起的作用尚不明確。Saidel(1982)報道視葉的神經(jīng)纖維與基葉和嗅葉的神經(jīng)纖維相互連接。Di Cosmo 和Di Cristo 報道在真蛸CNS 的傳出神經(jīng)纖維中分別檢測到了FMRFamide 和GnRH 的陽性信號(Di Cosmoet al, 1998), 這些神經(jīng)肽甚至可以在深層視網(wǎng)膜內(nèi)層、叢狀層和外層發(fā)揮生理作用, 進而調(diào)節(jié)傳入的視覺系統(tǒng)信號。在另一項研究中Di Cosmo 等(1998)指出, 神經(jīng)肽APGWamide 分布于嗅葉的神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維。盡管有免疫陽性的神經(jīng)纖維不與腺體細胞相接觸, 但結(jié)果表明 APGWamide 能協(xié)助FMRFamide 和GnRH 參與控制視腺的活動。本文ISH結(jié)果表明SpFaGPCR強烈表達于視葉的中央髓質(zhì)區(qū)、纏卵腺的葉瓣外層、視網(wǎng)膜的感光細胞感光體部分,從而我們推測神經(jīng)肽FMRFamide 或者FLP 可能通過與SpFaGPCR的互作在“視葉-腦-纏卵腺”通路上在神經(jīng)內(nèi)分泌水平調(diào)控生殖。Wells(1978)研究證明, 真蛸視腺神經(jīng)被切除或大腦的擬柄狀區(qū)被破壞將導(dǎo)致腺體增大、性腺增生。雖然效果不如切除視腺明顯, 但是切斷視神經(jīng)或切除視葉也會產(chǎn)生類似的反應(yīng)。據(jù)此他們推測, 光照可調(diào)控視腺的生理功能, 由復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)該種抑制, 該信號網(wǎng)絡(luò)從視網(wǎng)膜到視葉,再到視腺。此外, 對人類視網(wǎng)膜GPCR 的研究同樣表明 GPCR 對視覺的形成起關(guān)鍵作用(Nemetet al,2015), 據(jù)此, 我們推測虎斑烏賊視網(wǎng)膜感光細胞中的SpFaGPCR可能參與介導(dǎo)其視覺信號的形成與傳導(dǎo), 進而調(diào)控虎斑烏賊的生殖活動。

4 結(jié)論

本研究采用同源克隆法與RACE 技術(shù)首次獲得了虎斑烏賊 FMRFamide 的 G 蛋白偶聯(lián)受體基因cDNA 全長序列, qRT-PCR 技術(shù)檢測結(jié)果表明SpFaGPCR在虎斑烏賊視葉、視腺、腦、纏卵腺中表達量顯著高于其他組織, ISH 技術(shù)定位分析發(fā)現(xiàn)SpFaGPCR在虎斑烏賊視葉的髓質(zhì)區(qū)、視網(wǎng)膜的感光細胞和纏卵腺的瓣葉外層具有明顯的陽性雜交信號。